蛋白酶的研究历史、发现及在健康和疾病中的作用(续1)

范美红 译自.，Vol.294(2019)，№5：1643～1651

王晶晶 审

3 金属蛋白酶特性和生理功能的研究进展

金属蛋白酶已经成为一组引人关注的酶。它们存在于所有生物界中，并在进化过程中广泛扩展。1980 年，研究人员共鉴定出11 种金属蛋白酶。目前，已知小鼠和人类的基因组编码了大约200种金属蛋白酶，是蛋白酶领域中最大的一组酶。这些酶中大多数由细胞分泌或与质膜相结合，在细胞周围和细胞外发挥作用。在胚胎发育过程中，它们参与组织的分化和重塑，在成年组织中参与加工具有生物活性的肽和细胞因子。用于控制血压的血管紧张素转化酶抑制剂是人类使用最广泛的抑制剂之一。金属蛋白酶还与许多疾病有关，如癌症和炎症性疾病。它们和其抑制剂(如金属蛋白酶组织抑制剂)具有很大的医学价值，临床试验结果既让人乐观，又让人失望。利用金属蛋白酶的合成抑制剂来抑制癌细胞的转移为人类战胜癌症展现了巨大的希望，但尚未发挥其潜力。

锌金属蛋白酶超家族包含大多数已知的金属内切蛋白酶(在蛋白质底物内部裂解肽键的含锌酶)。该超家族由六个相关的进化家族组成：解联蛋白和金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinases，ADAMs)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、妊娠相关血浆蛋白酶、沙雷菌蛋白酶、利什曼原虫表面蛋白酶(leishmanolysins) 和龙虾肽酶。这些酶家族中的每一个家族都有多个单独的酶，并且在发现和生理功能上都有极具吸引力的故事。有趣的是，不同家族的蛋白酶结构域在氨基酸序列上具有相对较低的相似度。然而，所有的催化结构域都具有惊人相似的三维结构，活性位点有一个保守的锌结合结构域[HEXHXX(G/N)XX(H/D)]以及一个保守的甲硫氨酸转角(Metturn)。下面将重点讨论龙虾肽酶家族，特别是该家族的穿膜肽酶。

龙虾肽酶家族是20 世纪80 年代和90 年代进行大量克隆和测序的结果。通过序列相似性鉴定，该家族最初的成员包括：龙虾肽酶，来自人骨的骨形态发生蛋白-1(bone morphogenetic protein-1，BMP-1)，来自小鼠肾脏和人类肠道的穿膜肽酶，来自非洲爪蟾胚胎部分序列的UVS.2 (uterine-egg viteline envelope soluble)。之所以命名为“龙虾肽酶家族”，是因为奥斯塔欧洲螯虾(Astacus astacus) 的龙虾肽酶是该家族中第一个被测序和描述的酶。龙虾肽酶存在于动物和细菌中，目前还没有在植物和真菌中发现。随着对许多物种的基因组测序，已经发现了数百种的龙虾肽酶。在人类和小鼠的基因组中，已经发现了6 个龙虾肽酶家族基因，其中包括2 个穿膜肽酶基因、3 个骨形态发生蛋白-1(bone morphogenetic protein-1，BMP-1)/tolloid 样基因和1 个ovastacin 基因。在黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫中，分别发现了16 种和40 种龙虾肽酶。在黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫中，大多数龙虾肽酶基因的功能尚未确定，但在寄生线虫中，龙虾肽酶参与蛋白质在细胞外基质中的移动，在水螅中参与头部再生。

在已描述的龙虾肽酶中，螯虾的龙虾肽酶分子量最小，含有一个200 个氨基酸残基的催化结构域。从cDNA 测序中得知，在蛋白质合成过程中有一个前原(prepro) 序列被切割。到目前为止，在所有测序的龙虾肽酶家族成员中都发现了前(pre) 序列或信号序列，估计是为了引导蛋白质进入内质网和分泌途径。原序列(pro sequence)作为一种调节机制，能使酶失去活性。活性螯虾蛋白只含有一个约20 kDa的催化结构域，而大多数龙虾肽酶家族成员含有一个或多个非催化结构域，位于蛋白酶结构域的C 端。许多含有一个或多个表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)样结构域，以及一个CUB(补体亚组分Clr/Cls、胚胎海胆蛋白UEGF、BMP-1)结构域。这些对蛋白与蛋白或蛋白与底物之间的相互作用很重要。非催化结构域是造成家族成员大小不一的原因，大小从200 个氨基酸(小龙虾龙虾肽酶)到900 个氨基酸(小鼠BMP-1) 不等。此外，许多更复杂的龙虾肽酶是高度糖基化的蛋白质，进一步提高了分子质量和复杂性。

龙虾肽酶家族成员——穿膜肽酶是一类独特的寡聚金属蛋白酶，包含两个进化上相关的α和β 亚基的同源和异源寡聚体。它们体现了锌金属蛋白酶超家族成员的复杂性。

穿膜肽酶发现于1980 年，是在糖尿病小鼠中寻找蛋白酶的结果。在由链脲霉素诱导的糖尿病BALB/c 小鼠中寻找蛋白酶活性和蛋白质周转变化的过程中，使用各种底物测量了肝脏、肾脏和肌肉组织中的蛋白酶活性。与对照组小鼠相比，在糖尿病小鼠组织中测量的肝脏降解率或蛋白酶活性没有发现根本变化。然而，研究发现，在碱性条件(pH9) 下，以偶氮酪蛋白(azocasein)为底物时，这些小鼠的肾脏具有相对高的活性。然后，从BALB/c 小鼠肾脏中纯化了这种酶，发现它是一种糖基化的膜结合金属蛋白酶，α亚基分子质量为85 kDa～90 kDa。该亚基形成二硫键二聚体，二聚体形成320 kDa 的四聚体。Sterchi 等(1982) 报道了人体中与小鼠穿膜肽酶相当的一种名为对氨基苯甲酸(para aminobenzoic acid，PABA) 肽酶(以水解底物命名)的肠道酶，但这两种酶之间的相似性直到它们被克隆和测序后才被发现。

1983 年，BALB/c 小鼠有一段时间无法使用，笔者实验室从另外两个近交系C3H/He 小鼠和CBA 小鼠中收集肾脏。与BALB/c 小鼠相比，这些小鼠肾脏中的偶氮酪蛋白酶(azocaseinase)活性非常低。因此，Beynon(1983) 撰写了一篇阐述多种C 系小鼠缺陷的论文。梅奥医学中心的小鼠免疫遗传学家Chella David 注意到了该论文，他告诉笔者，许多C 系小鼠是为移植研究培育的，在主要组织相容性复合体基因上存在差异。这些观察结果促使相关研究人员开展合作，并发现小鼠17 号染色体上靠近主要组织相容性复合体的一个基因(Mep-1a)能够调控小鼠肾脏中穿膜肽酶活性的表达水平。现在已知，Mep-1a 可编码穿膜肽酶的α 亚基。对缺陷型或穿膜肽酶低活性小鼠品系的进一步研究显示，它们表达的是含有β 亚基的穿膜肽酶的潜伏形式。穿膜肽酶的β 亚基与α 亚基在催化结构域上具有58%的相似性，并由小鼠18 号染色体编码，这是一个由单一基因分化进化的例子。对不同品系小鼠的穿膜肽酶α 亚基和β 亚基的研究发现，穿膜肽酶α 亚基与β 亚基在小鼠肾脏中有几种不同的组合，形成穿膜肽酶的四级结构，以及穿膜肽酶的A 和B 异构体，分别为EC 3.4.24.63和EC 3.4.24.18。尚不清楚造成一些近交系小鼠成年后缺乏穿膜肽酶α 亚基表达的原因，但已知这受进化的调控，因为所有小鼠品系在胚胎期和青春期前肾脏都能表达穿膜肽酶α 亚基和β 亚基。

20 世纪80 年代对穿膜肽酶的研究是利用从成年小鼠肾脏刷状缘膜中分离的蛋白质进行的。在偶氮酪蛋白酶活性高的小鼠体内，穿膜肽酶含有α 和β 亚基，而在该酶活性低的小鼠(缺陷型品系) 体内，穿膜肽酶只含有β 亚基。这种小鼠的穿膜肽酶α 亚基在质膜上是有活性的，而β 亚基主要是潜伏的，但可以被类胰蛋白酶激活。对穿膜肽酶α 亚基激活的研究表明，去除原序列可以形成包括两个N 端残基的氢键，这对酶的结构至关重要。随着20 世纪80 年代和90 年代分子生物学的发展，特别是克隆、测序和定向诱变等技术的发展，对穿膜肽酶α 亚基结构和功能的研究取得了快速的发展。

穿膜肽酶异构体的结构相当复杂，具有多域、多聚体结构。寡聚体由穿膜肽酶α 亚基和/ 或β 亚基的二硫键连接的二聚体组成，这些二聚体可能会自联，形成分子质量更大的异构体。同源穿膜肽酶A 只含有α 亚基，异源穿膜肽酶A 含有α 亚基和β 亚基，而同源穿膜肽酶B 只含有β 亚基。两个亚基都是糖基化的，天冬酰胺连接糖对二硫键的形成、低聚反应、稳定性、分泌和酶活性很重要。至于结构域结构，两个亚基都含有一个信号序列、原序列、蛋白酶(催化) 结构域、甲基偶氮甲醇(methylazomethanol，MAM) 结构域、肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF)结构域、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)样结构域、跨膜结构域和C 端小尾巴(6～26个氨基酸)。非催化结构域对蛋白酶的运输、结构和活性很重要。α 亚基和β 亚基结构域的一个明显区别是，穿膜肽酶α 亚基在EGF 样结构域和TRAF 结构域之间含有一个I(插入的) 结构域，而β 亚基没有。在分泌途径的成熟过程中，I 结构域内有一个蛋白酶切，导致该亚基从膜上释放出来。通过定点诱变将I 结构域从穿膜肽酶α 亚基中移除，结果显示I 结构域对于蛋白质水解和亚基从膜上释放是必要和充分的。因此，只含有穿膜肽酶α 亚基的穿膜肽酶异构体被分泌到细胞外。二硫键连接穿膜肽酶α 亚基二聚体往往会以非共价键结合成1 MDa～6 MDa的高分子质量复合物，其是生物系统中分泌的最大的蛋白酶复合物之一。这种自联作用使单体穿膜肽酶A 集中在细胞外环境中，并且可能对稳定性和作用很重要，特别是在感染部位和肠道的恶劣环境中。与细胞膜相关的穿膜肽酶都含有穿膜肽酶β 亚基，可能由穿膜肽酶β 亚基二硫键连接二聚体、形成四聚体的穿膜肽酶α 亚基/β亚基二聚体或与穿膜肽酶α 亚基二聚体非共价结合的穿膜肽酶α 亚基/β 亚基二聚体组成。对穿膜肽酶β 亚基二聚体的交联研究揭示了蛋白质内有一个域间和域内接触的紧凑结构，包括TRAF-TRAF 相互作用。人类穿膜肽酶B 的X 射线结构显示，活性位点靠近膜，这对该亚型的脱落活性有影响。

穿膜肽酶在肾脏和肠道刷状缘膜上的定位最初是通过细胞分级分离研究和随后的免疫组织化学研究推断出来的。穿膜肽酶也在白细胞中表达，对这些细胞的研究表明，在敲除穿膜肽酶β 亚基基因的小鼠中，这些细胞通过细胞外基质的能力减弱。穿膜肽酶在单核细胞和自然杀伤细胞中的表达，会影响这些细胞的内稳态。人类穿膜肽酶α 亚基和β 亚基在表皮的不同层中表达，并参与细胞增殖和人类皮肤细胞的终末分化。研究发现，胰腺、睾丸、胎儿肝脏、胚胎干细胞和脑组织中都检测到了穿膜肽酶亚基的mRNA，其中表达水平最高的是肾脏和肠。因此，研究人员主要在这些组织中研究穿膜肽酶的生理功能。通过构建基因敲除小鼠，同时对小鼠进行挑战，研究已经收集到关于穿膜肽酶生理功能的其他见解。

穿膜肽酶能够水解各种底物，从肽到蛋白质。小鼠穿膜肽酶B 对裂解部位的酸性残基有明显的偏好。相比之下，同源穿膜肽酶A 更喜欢裂解含有小的或疏水氨基酸残基的键。这些偏好导致肽底物的水解作用存在明显差异。例如，穿膜肽酶B 可以裂解促胃液素和骨桥蛋白，但穿膜肽酶A不能,穿膜肽酶A 可以裂解缓激肽和P 物质，但穿膜肽酶B 不能。穿膜肽酶B 还可以裂解细胞表面蛋白，如E-钙黏蛋白和上皮细胞钠通道，从而影响细胞与细胞的相互作用和离子运输。穿膜肽酶A 可裂解紧密连接蛋白——闭合蛋白，这会损害上皮屏障功能，增强单核细胞迁移。穿膜肽酶异构体对细胞因子的激活和降解也有不同的偏好，穿膜肽酶异构体的平衡可能对细胞因子谱和炎症反应进程有重要影响。在寻找人类穿膜肽酶的底物时，高通量技术发现了许多底物以及穿膜肽酶与ADAMs 之间有趣的联系。

充分的证据表明，穿膜肽酶与一些疾病有关，这将是未来需要探索的领域，并有望治愈这些疾病。例如，穿膜肽酶存在于炎症部位，会影响白细胞的迁移，降解紧密连接蛋白，并激活/降解细胞因子。利用穿膜肽酶α 基因敲除小鼠进行的研究发现，在肠道疾病模型中，穿膜肽酶α 亚基表达减少增加了肠道的炎症反应。此外，人类甲基多巴α 亚基基因是炎症性肠病，特别是溃疡性结肠炎的易感基因。穿膜肽酶还会影响小鼠尿路感染进程。对小鼠的其他研究表明，穿膜肽酶与肾脏疾病的发病机制有关，人类甲基多巴β 亚基基因的多态性与比马印第安人的糖尿病肾病有关。穿膜肽酶在各种癌(如结肠癌和乳腺癌)细胞中都有表达，研究认为其在肿瘤细胞侵袭和迁移中起着一定的作用。研究还发现，穿膜肽酶在体内能裂解淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)，这意味着其在神经退行性疾病，如阿尔茨海默症的发生上起着一定的作用。最近对穿膜肽酶与肠道中黏蛋白相互作用的研究发现，它在保护宿主上皮细胞免受细菌侵害和影响肠道菌群组成方面发挥着一定的作用。

4 小结

未来的挑战之一是了解蛋白酶在生物体内的功能，并能在特定组织中选择性地激活和抑制它们。蛋白酶存在于其他分子和蛋白酶的网络环境中，存在于细胞间、细胞膜和细胞外环境中，这些环境无疑在测定其功能上至关重要。大系统理论，如结合运用遗传学、细胞生物学以及蛋白质组学来鉴定底物和活性蛋白酶的降解组学，将是了解和调控蛋白酶系统所必需的。Herb Tabor为JBC 打下了基础，研究从单种酶的鉴定和特性描述进入了复杂的多组分系统，以阐明蛋白酶在生命结构中的作用。

(续完)