血管疾病治疗新靶标:STIM1和Orai1*

赵 慧，何 芳

钙离子(Ca2+)是常见的第二信使，不同于其它第二信使，其主要位于细胞外或存储于内质网(endoplasmic reticulum，ER)等细胞器内。静息状态下细胞内游离Ca2+浓度(intracellular Ca2+concentration，［Ca2+］i)约为细胞外的 1/20 000，受体激活或生物信号刺激可通过改变［Ca2+］i进一步发挥生物放大效应。［Ca2+］i的升高主要通过胞内Ca2+释放和胞外Ca2+内流两大途径。随着胞内钙库的排空，位于质膜上的Ca2+内流通道被激活，使Ca2+由胞外进入胞质内，这个过程称为钙库操纵的钙内流(storeoperated calcium entry，SOCE)，其通道称为钙库操纵的钙通道(store-operated calcium channel，SOCC)。近来研究证实组成SOCC的主要蛋白是:Ca2+感受蛋白基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)［1-2］和 Ca2+通道蛋白 Orai1［3-4］。内质网释放Ca2+既可有赖于三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)的产生及IP3受体激活引发的主动耗竭，也可经药物如毒胡萝卜素(thapsigargin，TG)通过抑制内质网膜上Ca2+-ATP酶诱发的被动耗竭。Ca2+库的耗竭引起位于ER细胞膜上Ca2+感受器STIM1寡聚化并向最近的内质网-细胞膜连接处(endoplasmic reticulum-plasma membrane，ER-PM)移动，位于质膜上的Orai1通道也同时移向同一ER-PM连接处并被STIM1寡聚物通过C端的第100位氨基酸与Orai1的N端直接相互作用所激活［5］。

除了STIM1和Orai1之外，还存在由独立基因编码的STIM和Orai家族中的其它成员:STIM2、Orai2以及Orai3。STIM2参与维持静息状态时［Ca2+］i调节，当这些蛋白在人胚肾(human embryonic kidney，HEK)细胞中共同表达时，STIM蛋白激活Orai2和Orai3的方式与其激活 Orai1的方式相同［5-7］。Mercer等［8］在HEK293细胞中对 Orai异常表达的研究证明，所有 Orai蛋白都能增强SOCE，功效依次是Orai1＞Orai2＞Orai3;且Orai3有能力补救 Orai1敲除对细胞产生的影响。DeHaven等［5］的研究显示，Orai1、Orai2、Orai3通道都能被胞外 Ca2+抑制，且Orai3通道对钙库排空过程有一定的抑制作用。Ca2+信号和SOCE在多种正常细胞以及细胞功能障碍的过程中都发挥着重要作用，其中包括血管系统。

1 血管平滑肌细胞增殖及舒缩异常相关性疾病

1.1 SOCE在血管平滑肌细胞表型改变、增殖和新内膜形成中的作用 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是构成血管壁的主要细胞类型，在维持血管正常生理功能中起重要作用。对血管壁的机械或炎症刺激可引起血管平滑肌细胞由成熟的、静止的、具有收缩性质的收缩表型转变成未成熟的、具有增殖和迁移能力的分泌表型。血管平滑肌细胞表型转化促使血管平滑肌细胞增殖和迁移是高血压、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等血管疾病发病的关键环节。

Ca2+信号在调节血管平滑肌表型改变、增殖和迁移中发挥重要作用，研究发现在大鼠血管平滑肌细胞中STIM1和Orai1是SOCE和Ca2+释放引起的Ca2+电流(Ca2+release-activated Ca2+current，ICRAC)的重要组成部分［9］。与处于静止状态的新鲜分离的VSMCs相比，分泌表型的VSMCs中SOCE增多，并与STIM1和 Orai1蛋白的表达增多相关［9-10］。沉默STIM1或Orai1明显减少TG或血小板衍生生长因子激活的 SOCE，以及血管平滑肌细胞的增殖和迁移［9-11］，沉默 STIM2、Orai2、Orai3、瞬时受体电位通道1(transient receptor potential channel 1，TRPC1)、TRPC4或TRPC6不影响SOCE。在大鼠颈动脉球囊拉伤模型中亦发现新生内膜胞质中的STIM1和Orai1表达增多［11-13］，沉默 STIM1或 Orai1及抑制 ICRAC激活，可抑制活化T细胞的核因子(nuclear factor of activated T cell，NFAT)核转位的激活从而减少血管平滑肌细胞增殖和新生内膜的形成［12-14］。在代谢综合征Ossabaw猪模型的冠脉平滑肌细胞中SOCE也增多［15-16］，且与 STIM1、Orai1 和 TRPC1 mRNA 蛋白水平增高有关，经运动锻炼则减弱了STIM1/TRPC1的过表达和SOCE［15］，而此疾病过程中冠脉平滑肌细胞表型是否改变尚不清楚。

1.2 SOCE在自发性高血压大鼠血管舒缩中的作用

Giachini等［17］对高血压大鼠大动脉的研究发现:与WKY大鼠相比较，24周龄发生脑卒中的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)有较高的收缩压和基础张力，而当用含有Ca2+的细胞外液灌流时，SHR主动脉血管条较WKY大鼠产生更明显的收缩反应;用TG将进一步增加主动脉血管条的收缩反应(尤其在自发性高血压脑卒中大鼠)，上述作用可被ICRAC通道阻滞剂2-氨基乙氧基二苯硼酸酯(2-aminoethoxydiphenyl borate，2-APB)和钆(gadolinium，Gd3+)，以及 STIM1或 Orai1的中和抗体消除。免疫荧光显示SHR大动脉内STIM1和Orai1的蛋白表达增高。证实了STIM1和Orai1在高血压血管舒缩异常中的重要作用，阐明了STIM1和Orai1的过度激活使细胞内Ca2+稳态破坏为高血压血管功能障碍的重要机制之一。因而，这些蛋白作为血管闭塞性疾病防治的新靶标具有潜在应用价值。

2 血小板和血栓形成

2.1 血小板活化及血栓形成机制 当血管壁受损时，从损伤部位释放的刺激可触发血小板活化和聚集，促使血液凝固，起到止血作用;但是，当损伤严重或过度刺激时，血小板聚集和血液凝固过度反应，在血管内形成血块将阻碍血液流动，这种病理性反应过程称为血栓形成。血小板活化是形成血栓的主要原因，因此也是抗血栓治疗的关键。Ca2+进入细胞内激活血小板使血小板黏附于暴露的血管内皮并聚集形成血栓。不同的激动剂主要通过2种途径引起［Ca2+］i升高促使血小板激活。其一是可溶性激动剂如凝血酶、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、血栓素A2通过G蛋白偶联性受体途径激活血小板，在此过程中经磷脂酶C β(phospholipase C β，PLCβ)激活促使 IP3生成［18-19］;其二是黏附性配体(如血管假性血友病因子、胶原、纤维蛋白连接素等)激活血小板表面的受体如血小板糖蛋白(glycoprotein，GP)Ib/V/IX、GPVI及结合素类，并且经磷脂酶 Cγ(phospholipase C γ，PLCγ)激活促使 IP3产生［20］;虽然这2条通路都可以通过生成IP3而激活SOCE，但是G蛋白主要引起血小板与血小板间的相互作用，而GPIb/V/XI和GPVI途径通过血小板与基质间黏附作用引起血小板聚集，这些过程的细胞机制尚不清楚。

2.2 STIM1和Orai1在血小板活化及血栓形成中的作用 研究发现血小板高表达STIM1和Orai1，因此猜想STIM1和Orai1可能在血小板发挥功能时起重要作用。为验证此设想Bernhard等［21-23］小组设计了3种SOCE受损的小鼠系:STIM1sax/sax(激活的STIM1 EF hand D84G突变体)、STIM1-/-和Orai1-/-;来自STIM1sax/+杂合型小鼠系研究发现(基于纯合型动物的高致死率和低存活率:72只后代中仅存活1只，大部分研究工作是在杂合型小鼠中进行的)，此杂合型小鼠的SOCE和血小板功能受损，血小板预活化时，基础Ca2+浓度升高并且持续时间缩短，与野生型小鼠相比，STIM1sax/+小鼠血小板中TG诱导的Ca2+库释放和Ca2+内流分别降低了60%和70%(细胞外液中有2 mmol/L Ca2+)，在STIM1变异的血小板内只有胶原受体特异的激动剂如胶原相关肽、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)等介导的 Ca2+内流减少［22］，这些受体与酪氨酸免疫受体活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activating motif，ITAM)有关，通过激活PLCγ途径引起Ca2+内流，提示涉及T细胞受体激活［24］，而 G蛋白偶联的激动剂介导的Ca2+浓度升高未受影响［22］。进一步研究发现在STIM1sax/+小鼠血管内胶原表面的附着力较野生型小鼠弱，其尾部采血的凝血时间明显延长，而血栓闭塞时间在STIM1sax/+组小鼠和野生型小鼠相似(运用一个特殊的损伤模型，此模型中血栓形成主要由凝血酶介导)［22］。

在STIM1-/-小鼠的血小板内，由CRP或G蛋白偶联的激动剂引起的Ca2+内流均被抑制。但是，与野生型小鼠相比，STIM1-/-小鼠与STIM1sax/+小鼠相似，只有被胶原有关的激动剂触发时血小板聚集才减弱，而在被G蛋白偶联的激动剂触发时血小板聚集未受影响。在胶原覆盖的表面观察血栓形成时发现，与野生型小鼠相比，STIM1-/-小鼠的血小板形成较少的血栓，由变异血小板覆盖的体表面积和形成的血栓总容量减少分别约42%和81%。体内实验显示，STIM1-/-小鼠尾部采血凝血时间稍有延长，血管闭塞时间明显延长，并且对缺血性脑梗塞有较强的抵抗［23］。

在人类和小鼠的血小板中，Orai1是Orai家族的主要成员，因为敲除Orai1的小鼠表现出高死亡率。Braun等［21］将Orai1-/-骨髓移植到受辐射的野生型小鼠体内，产生Orai1-/-嵌合小鼠，在此小鼠血小板内TG激活的SOCE明显被抑制，证明Orai1是血小板中SOCE的主要组成部分。与STIM1-/-血小板相似，Orai1-/-血小板中Ca2+内流被CRP、ADP和凝血酶抑制。但与野生型小鼠相比，Orai1-/-小鼠G蛋白偶联的激动剂引起的血小板聚集未受影响，但对低浓度胶原或CRP的反应减弱了。静脉注射胶原或肾上腺素引起野生型小鼠肺栓塞使其在20 min内死亡，但是大部分Orai1-/-小鼠(6/7)存活［22］。然而，在动脉血栓形成模型中，全部野生型小鼠的动脉完全闭塞，4/10沉默Orai1的小鼠能维持血流量。在FeCl3诱导的小动脉损伤模型中，血栓形成主要依靠凝血酶，14/15 Orai1-/-小鼠形成闭塞性血栓，形成血栓的过程与野生型小鼠相同。与STIM1-/-小鼠相似，Orai1-/-小鼠对缺血性脑梗塞具有较强抵抗［21］。采用在血细胞中只表达 Orai1R93W杂合子的小鼠模型(在缺少SOCE和ICRAC的免疫缺陷的病人中发现，Orai1R93W是Orai1突变形成的)的研究发现［25-26］:当Orai1R93W血小板被 TG或激动剂(convulxin激动GPVI)激活后Ca2+内流受损，但血小板聚集和血栓形成未受影响［25］;由于小鼠隐含Orai1R93W突变基因与免疫缺陷病人Orai1R91W突变基因相似，而免疫缺陷病人没有表现出明显的出血倾向和凝血异常，此研究结果与人们长期在临床上观察结果一致。但是，研究人员进一步发现Orai1R91W的血小板表面暴露的磷脂酰丝氨酸减少了80%(血小板促凝活性物质的形成需要细胞表面的磷脂酰丝氨酸，并且被胞质中 Ca2+浓度升高激活)［25］，Nieswandt小组佐证并进一步阐明了其作用机制:STIM1-/-小鼠和Orai1-/-小鼠通过GPVI通路抑制磷脂酰丝氨酸暴露及血栓形成，而与凝血酶激活无关;STIM2在这一过程中没有发挥任何作用［27］。

综上所述，在血小板中STIM1和Orai1是SOCE的重要组成部分，并经GPIb-GPVI-ITAM通路控制Ca2+内流。在动脉中STIM1和Orai1的减少减弱了由胶原触发(通过GPVI/PLCγ通路)的血栓形成。相反，STIM1和Orai1在创伤性出血的止血中未见明显作用。

3 内皮细胞和血管新生

内皮细胞亦可通过SOCE途径升高［Ca2+］i，在内皮细胞屏障、运动、迁移、增殖及血管发生等多种功能中发挥作用。实验发现起源于不同血管床的内皮细胞，如人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)和肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs)等均表达STIM和Orai蛋白，且具有STIM和Orai构成的SOCE和ICRAC，内皮激动剂如血管内皮生长因子或凝血酶通过STIM1/Orai1介导的SOCE调节胞内Ca2+内流并参与HUVECs增殖;沉默STIM1或Orai1使细胞周期停滞在 S期和 G2/M 期［28］。此外，Orai1和SOCE在脐静脉血管新生中也发挥作用［29］，沉默Orai1或STIM1可抑制由血管内皮生长因子介导的Ca2+内流和血管内皮细胞迁移;进一步研究证实Orai1是脐静脉管腔形成的关键，Ca2+释放激活的Ca2+通道 (Ca2+release-activated Ca2+channel，CRAC)的抑制剂S66在血管新生体内模型中也抑制了血管新生过程中管腔形成和血管生长［29］。在人的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)中(包括外周血和脐带血来源)也发现了SOCE并有大量的Orai1和STIM1表达，被认为是构成SOCE的重要部分［30］，沉默STIM1可减少肝细胞生长因子诱导的SOCE和内皮祖细胞的增殖，提示Orai1或STIM1是血管新生过程中的靶蛋白。

4 心脏功能和心肌肥大

心肌肥厚(心肌重塑)是引起心血管疾病发病率和死亡率显著升高的独立危险因素，研究表明心脏的自分泌、旁分泌、内分泌系统及其受体介导的细胞信号转导途径和机械张力受体及其信号转导途径在心肌肥厚的发生中起着重要作用，且它们之间密切相关、相互影响［31］。细胞内 Ca2+是心肌肥大的信号，在心肌肥厚和基因表达中发挥关键作用［32］。研究发现小鼠的心肌细胞表达STIM1，沉默STIM1抑制了TG和内皮素 1(endothelin-1，ET-1)引起的Ca2+内流及ET-1介导的NFAT的活化，并防止了促肥大因子如ET-1、苯肾上腺素介导的心肌新生基因增多［33］。Voelkers等［34］的研究发现在新生心肌细胞中，Orai1和STIM1是TG介导SOCE和钙瞬变必需的，沉默Orai1可明显减少静息状态及促肥大因子苯肾上腺素刺激状态下心肌胚胎基因的表达、新生心肌细胞体积、磷酸化的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)及钙调神经磷酸酶的激活;而STIM1沉默仅可显著减少促肥大因子苯肾上腺素刺激作用下新生心肌细胞体积，对静息状态下上述指标变化无影响。上述研究结果证实了STIM1和Orai1在心肌肥大重塑中的作用，可作为防治心肌肥厚的新靶标。

5 结语

近来发现，STIM1和Orai1作为SOCE的调节蛋白存在于多种细胞中，包括心血管系统，上述研究结果已初步显示出STIM1和Orai1在心血管疾病发生、发展中的作用，但较少涉及Orai2和Orai3在其中的作用，需进一步阐述这些亚型的新作用，Orai亚型异源多聚体的出现增加了由特殊激动剂诱导的Ca2+信号的多样性从而完成特定的生理功能。未来的研究将更多阐明在心血管系统的不同细胞中天然STIM和Orai蛋白的功能、寡聚化模式及调节机制，了解不同细胞中Orai通道的结构与调节机制之间的细微差别，进而在分子水平实现选择性靶向作用治疗心血管疾病。

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