CpG ODN的特点及其在疾病中的最新应用进展

杜晓岩 刘春秀 满大鹏 徐品一

(佳木斯大学附属第二医院整形美容外科，佳木斯154000)

100多年以前，Coley首次发现细菌制品能够治疗非细菌感染性疾病。现在已经明确细菌DNA和合成的CpG ODN(CpG Oligodeoxynucleotide)是强效的免疫激动剂。CpG ODN具有高效低毒、性质稳定、易于合成等优点，目前已应用于哮喘和其它变态反应性疾病、感染性疾病和肿瘤等的研究中并取得显著疗效，初步应用于临床研究。

1 CpG ODN的发展史

在十八世纪九十年代，纽约外科医生Coley［1］用细菌使肿瘤发生退行性变，当时人们把此疗效归因于内毒素，约100年后，才有人证明细菌DNA自身能够激活免疫系统［2］，通过对合成ODN的研究人们得知，这种免疫刺激作用是因为它含有具有特异性侧翼序列的非甲基化CpG基序［3］。2000年，Hemmi等［4］发现CpG ODN的免疫刺激作用是由TLR9介导的，学者们将这一类富含CpG基序的ODN称为CpG ODN［5］。

2 CpG ODN的分类

根据磷酸骨架、CpG二核苷酸的位置和数量、回文序列和它们对人外周血单核细胞的作用，CpG ODN被分成 A、B、C三类，三类 CpG ODN都能与TLR9作用，但它们活化的细胞类型和免疫刺激作用有很大差异。其中，B类CpG ODN是临床应用的研究热点［6］。还有文献提及由硫代磷酸骨架组成两个回文结构的P类CpG ODN，已用于体外实验调控固有免疫应答［7］。目前，很多学者正致力于新型CpG ODN的研发和临床前期实验，优化CpG ODN的性质和疗效。

3 CpG ODN的作用机制

CpG ODN通过细胞内化以小泡的形式进入细胞，小泡与内体融合，导致CpG ODN进入酸性的内体环境。CpG ODN与内膜上的TLR9相互作用，完成识别，随着内体成熟，CpG ODN被酸化，引发细胞内的氧化压力，导致经典的TLRS信号级联:MyD88(髓样分化因子88)-IRAK(IL-1受体相关激酶 )-TRAF6(TNF受体相关因子 6)，最终激活NF-κB和MAP激酶等转录因子，激活免疫细胞，包括树突状细胞(DCs)，单核巨噬细胞及B细胞;诱导淋巴细胞及树突状细胞的迁移;上调主要组织相容性复合物MHCⅡ类分子、CD40、CD80/B7-1、CD86/B7-2 等共刺激分子的表达。间接激活抗原特异性T细胞和NK细胞，激发获得性免疫应答。活化DCs、单核巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF)-ɑ、干扰素(IFN)-γ和白介素(IL)-6、IL-12等炎性因子，诱发Th(T辅助)1型炎症反应;活化的B细胞分泌IL-6，免疫球蛋白(Ig)G及IgM等。这样，CpG ODN与TLR9相互作用，有效地架起固有免疫和获得性免疫之间的桥梁［8］。

4 CpG ODN的安全性

CpG ODN已成功应用于动物模型，全身给药及局部注射等都不会形成脓肿。目前的动物实验中，CpG ODN的用量并没有导致任何显著的并发症，但由于TLR9活化作用诱导产生的IFN-ɑ，抗CpG ODN IgM抗体的产生，TNF-ɑ等细胞因子产物的积累，大剂量长期使用CpG ODN或将其与一些试剂(如脂多糖)等共同使用也会产生严重的并发症。在人类临床试验中，已有学者研究了 TLR9激动剂在0.002 5 mg/kg到 0.81 mg/kg范围内的安全性，但人类对于CpG ODN的最小耐受剂量还未确定，主要的并发症是剂量相关的局部注射反应(如疼痛、肿胀等)或全身流感样反应(如头痛、发热等)。根据剂量不同，全身性反应一般在12小时到24小时内出现，持续1～2天或更长，但不加TLR9激动剂，疫苗也会引起局部注射反应。以CpG ODN为佐剂的疫苗进行频繁注射时，局部反应较单独应用疫苗的反应稍稍增加，但一般都较轻微，在肿瘤学应用中CpG ODN大剂量局部注射可产生严重的注射局部反应，颅内应用还可引发癫痫，目前还不清楚是CpGODN引起的还是操作不当引起的［9］，因此，在CpG ODN用于大量患者之前还必须进行更加深入的研究。

5 CpG ODN的应用

5.1 哮喘及变态反应性疾病 变态反应性疾病的许多临床表现源自Th2型免疫应答。CpG ODN能够作用于浆细胞样树突状细胞(pDCs)、诱导Th1细胞分泌IFN-γ和IL-10、使Treg(T调节)细胞分泌转化生长因子(TGF)-β等抑制Th2细胞活化。CpG ODN对于治疗哮喘、过敏性结膜炎、过敏性鼻炎都有一定的疗效。科学家们将一种病毒样粒子处理的A类CpG ODN与屋尘螨提取物结合用于21名患者的免疫治疗，疗效显著:在治疗后至少38周内，结膜激发试验显示过敏性反应几乎完全根除，过敏性哮喘和鼻炎症状明显减轻［10］。有研究称CpG ODN可显著抑制哮喘模型的气道炎症反应，调节Th1/Th2平衡、调控TLR9表达［11］。CpG ODN滴眼对实验性变态反应性结膜炎具有显著的治疗作用［12］。一种B类CpG ODN与部分豚草属抗原共轭对鼠的免疫治疗疗效显著，将其作为过敏性鼻炎的疫苗用于人类评估它的作用，在Ⅰ期和Ⅱ期临床试验中，特异性的使Th2型免疫应答转向一种非过敏性和非炎症性Th1型免疫应答［13］，遗憾的是在第Ⅲ期临床试验中并没有出现以上疗效，其原因尚未明确，仍需进一步探究。

5.2 感染性疾病 CpG ODN能够活化NK细胞和单核细胞，引起Th1型免疫应答加强固有免疫，所以它可以单独应用或在预防接种中作为免疫佐剂而作用于感染性疾病。除了加强固有免疫之外，CpG ODN还能加强抗原特异性免疫，被用于治疗多种寄生虫病以及细菌及病毒感染性疾病。

5.2.1 寄生虫病 很多学者把CpG ODN单独或作为寄生虫抗原的免疫佐剂用以诱发保护性反应:加入CpG ODN和KMP-1112-31aa肽的BM-DCs有效降低利什曼原虫在内脏器官的负荷［14］;CpG ODN能够促进未感染过疟疾的人获得疟原虫特异性记忆B细胞(MBC)［15］;将 CpG ODN 与 ROP2 和 GRA4 重组蛋白分别应用或三者联合应用进行肌肉注射免疫小鼠，都能使鼠脑弓形虫虫量明显减少［16］。

5.2.2 细菌感染性疾病 腹腔内注射以CpG ODN为佐剂的炭疽吸附疫苗能够增加A/J小鼠的抗体反应速度、大小和活性［17］;CpG ODN能够促进Th1型免疫应答，增强小鼠抵抗结核分枝杆菌感染的能力，作为卡介苗佐剂皮下免疫BALB/c小鼠能提高卡介苗的免疫效应［18］;CpG ODN还可用于水产养殖业，如通过直接或间接的固有免疫应答增强新型免疫制剂QCDCR治疗罗非鱼鱼型链球菌感染的疗效［19］。

5.2.3 病毒感染性疾病 CpG ODN可以用于多种病毒感染性疾病。CpG ODN能够增强机体对乙肝表面抗原的免疫应答［20］。用CpG ODN治疗丙肝是目前研究热点，主要的治疗方法是结合聚乙二醇干扰素和利巴韦林，直接加入抗病毒药物进行持续治疗，结果发现感染的人中约20%能够自发的清除病毒［21］。CpG ODN能够预防鼠上呼吸道流感感染［22］，最新研究显示它对禽流感、非典型性肺炎都有显著的治疗作用;CpG ODN还可能防止艾滋病病毒(HIV)-1传播，预防和治疗顽固性的1型糖尿病、单纯疱疹病毒及猴痘病毒等多种病毒感染，可见CpG ODN对多种顽固致命的感染性疾病有较明显疗效，并且在疾病大规模爆发的预防和治疗方面有广阔的应用前景。

5.3 肿瘤 CpG ODN不仅能够诱导不伴有局部炎症反应的强烈Th1型免疫应答，诱导产生大量细胞因子，如TNF、IL-12和 IFN-γ等抵抗肿瘤，还能激活细胞，如NK细胞、细胞毒性T淋巴(CTL)细胞、B细胞等抵抗肿瘤。CpG ODN不仅能单独使用、作为免疫佐剂使用，还能够与其它抗肿瘤疗法联合应用。CpG ODN单独用药可以对膀胱肿瘤、宫颈癌、胃癌等有抑制作用，给药途径有多种，包括腹腔内注射、静脉注射、瘤内注射等，研究发现给药部位越接近肿瘤治疗效果越好［23］。CpG ODN作为佐剂提高免疫治疗效果，这种联合免疫疗法能够对骨髓瘤、胸腺瘤、黑色素瘤等有治疗作用。此外，将CpG ODN与放疗、化疗、单克隆抗体等治疗方法联合应用也是目前用于治疗肿瘤的研究热点，它不仅能对放疗有增敏作用，优化化疗患者抗肿瘤的免疫微环境，还能减轻放疗后的辐射损伤和化疗后反应［24，25］，可能成为减轻患者痛苦，延长患者生命的重要制剂，CpG共轭单克隆抗体 HMFG-2能够显著减轻裸鼠胰腺癌肿瘤负担［26］。目前，已有一些CpG ODN进入了临床试验阶段应用于人类身上，CpG ODN(1018 ISS)与利妥昔单抗给患者静脉注射可能作为对抗非霍奇金淋巴瘤的有效免疫治疗方法［27］，CpG 7909的剂量0.01到0.64 mg/kg 2小时静脉输注到患者体内是安全的，并有免疫调节作用。在复发性恶性胶质瘤的Ⅰ期、Ⅱ期临床试验中，CpG ODN延长了志愿者的存活率，耐受性良好［28，29］。此外，CpG ODN 与化疗联合应用于治疗非小细胞性肺癌的第Ⅱ期研究阶段显示其能够提高患者的存活率［30］，但在第Ⅲ研究中发现紫杉醇/卡铂中加入CpG ODN并没有增强化疗药物的疗效而延长患者生命，因此学者并未进行进一步的研究［31］。

5.4 其他 在对CpG ODN的研究中还发现它能够减轻酒精性肝损伤、减弱创伤后出血造成的心脏功能紊乱，促进伤口愈合等［32-34］，在口腔研究领域方面也展示出良好的应用前景，它能够通过调控IL-8等细胞因子保护牙龈和牙本质健康［35，36］，能够通过NF-κB途径调控成骨破骨相关因子，如 RANKL、OPG等的表达从而促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化［37］。

6 小结与展望

综上所述，CpG ODN不仅能够靶向活化TLR9，降低哮喘和其他变态反应性疾病的有害炎症反应，还能够治疗多种顽固性感染性疾病，甚至能够减轻和治愈多种肿瘤，并且在其它领域中也有广泛的应用。目前，CpG ODN的研究仍存在许多不足，如安全剂量、最佳给药途径尚未明确、对严重的晚期疾病疗效并不显著等，相信会有更多的学者致力于CpG ODN的研究，为CpG ODN的临床应用奠定坚实的基础。

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