精密肝切片技术在药物研究中的应用

周 璐， 乔静怡， 金若敏

(上海中医药大学药物安全评价中心，上海201203)

肝脏含有的丰富的代谢酶，是外源性物质体内代谢和处置的重要场所。考虑到肝脏结构的复杂性和肝代谢、生物转化、内分泌等功能的多样性，人们设计出了肝细胞体外培养、肝微粒体培养、肝脏灌流等［1-3］多种体外模型用于肝脏的研究。作为研究肝脏所有细胞类型相互作用的模型——肝精密切片 (precision-cut liver slice，简称肝切片)于1923年由Warburg首先提出并开始加以应用。下面对这一技术的特点和应用加以概述。

1 精密肝切片的制备及特点

1.1 精密肝切片的制备 将大鼠或其他实验动物处死后，在无菌环境下取出肝脏，并立即用4℃预冷的含氧量为95%O2×5%CO2的DMEM培养液冲洗去残余血迹。用手持打孔器取10 mm×10 mm2大小的组织块放入含有缓冲液的Krumdieck切片机的标本槽中进行切片，切片的厚度为250～300μm，厚度太厚 (＞500μm)会限制氧的扩散使肝切片出现缺血性损伤;太薄 (＜200μm)则使切片中损伤的细胞所占比例过大。整个切制过程均应在4℃左右的无菌环境下操作，以降低肝细胞的代谢功能及避免潜在的氧化损伤。如果需进行长时间的培养也可在培养液中加入一定量的抗生素。

肝切片培养的常见方法分为两类:一类为静态培养系统，即将肝切片置于含适量培养液的培养瓶中，每瓶1片，37℃、水浴振荡密闭培养，在该培养系统中肝切片的活性可保持3 h左右。另一类为动态培养系统，肝切片放入一个盛有培养液的培养瓶中，培养瓶置于恒温旋转器上，在37℃下以一定转速旋转培养，在此培养系统中肝切片的活性可延长至20 h。培养后，应用高效液相等技术检测培养基中各项功能指标的变化，将肝切片制成组织匀浆以检测其中酶的活性和基因的表达，或置于福尔马林中固定，制成病理切片，观察组织学的变化［1-4］。

1.2 精密肝切片的特点 肝切片是一项介于器官与细胞水平之间的体外培养技术，早期由于技术的限制，该技术存在可重复性差和培养维持时间短等缺点，在当时并不被人们所认可。直到1986年Krumdieck等提出了动态培养系统和Krumdieck组织切片机的出现。使得快速大量制备均一肝切片并维持长时间活性成为可能［5］。与其他体外培养技术相比，肝切片能够更好的模拟肝脏的体内环境，并可直观观察药物的代谢、药物所诱导的酶的变化和组织学的改变，为临床试验提供依据。

肝切片相较于其他体外培养技术主要有以下的优点:(1)可以提供一个开放的研究药物代谢的模型。

(2)避免了因细胞分离过程中蛋白酶对细胞造成的损害，维持了细胞间及细胞与基质间的联系。

(3)保存一定的组织结构，维持了肝腺泡功能和结构的完整性。

(4)可以考察酶区域特异性表达和组织学改变。

(5)最为重要的一个特点是可以将同一个体的肝脏的亚细胞结构如肝微粒体的代谢和肝切片的代谢同时进行比较。

2 精密肝切片的应用

随着技术水平的提高，肝切片已广泛应用于药物研究，如探讨药物代谢途径和产物、对药物的毒性进行评价和预测、研究药物代谢种属和年龄的差异和研究药物对肝纤维化的作用机制等。

2.1 对药物代谢的研究 肝脏具有丰富的代谢酶系，受试药物经过与肝切片共培养时，可以发生与体内代谢相似的一相和二相反应。通过检测培养基和肝切片匀浆中代谢产物的变化，进一步了解药物在肝脏中的代谢过程。

药物代谢的研究中的一个重要方面是分析药物经肝代谢所产生的代谢产物。3-氟代麻黄碱 (3-fluoroethcathinone，3-FMC)是一个新开发的具有兴奋中枢神经作用的卡西酮类药物。Pawlik等采用兔肝切片对该药物的代谢进行研究。3-FMC与兔肝切片共培养，在培养5、30、180 min时取培养基用LC/MS-TOF技术检测其中代谢产物。发现3-fluorocathinone、 3-fluoromethcathinonediol、 3-fluoromethcathinoneimine和hydroxy-3-fluoromethcathinone四个主要的一相代谢反应产物，为3-FMC的代谢研究打下基础［6］。Laurent等发现乙醛的主要氧化产物4-羟基壬烯酸 (4-Hydroxy-2-nonenal，HNE)在体外肝切片经ω-氧化，形成 4-hydroxynonenoic acid(HNA)、glutathione-HNE-conjugate(HNE-GSH)、glutathione-1，4-dihydroxynonene-conjugate(DHN-GSH) 和cysteine-HNE-conjugate(HNE-CYS)等4个主要代谢产物［7］。

药物代谢研究的另外一个重要的方面则是研究药物对肝药酶的诱导效应。Palamanda等对30种化合物在肝切片中对肝药酶CYP1A1和CYP2B1的诱导效应进行了研究。将化合物和肝切片共培养一段时间后，应用RT-PCR技术检测肝切片匀浆中相应mRNA的表达，发现30种化合物中仅有2种可以同时诱导CYP1A1和CYP2B1 mRNA的表达，该实验结果与体内试验结果相类似［8］。结合免疫组化等技术，肝切片也为人们研究肝药酶诱导和在肝脏不同区域特异性表达提供了f方法与技术，Martin等应用人肝切片对苯巴比妥或环磷酰胺的肝药酶诱导效应进行研究。研究结果表明在药物共孵育48 h后，肝切片中CYP2B6和CYP3A4的mRNA表达、蛋白表达和酶活性都出现升高，发现有CYP2B6免疫反应阳性的肝细胞可分布于整个肝切片上，而CYP3A4反应阳性的肝细胞则主要分布于肝小叶的中央静脉周围［9］。

2.2 对药物毒性的研究 由于肝切片保存了一定的组织机构，维持了肝腺泡功能和结构的完整性，在生化和生理功能上与在体肝相似，因而在评价药物的毒性方面比其他的体外培养方法具有更大的优势。

苍术苷是菊科植物苍术Atractylodes lancea根茎中的一种糖苷型化合物，大剂量服用会导致一定的毒副作用，Obatomi等采用猪的肝或肾切片对苍术苷的毒性和代谢进行研究。将苍术苷200、500、1.0、2.0 mmol/L与猪的肝切片和肾切片分别孵育3 h并检测各项相关生化指标的变化。结果发现肝切片培养基中谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶(AST)未出现明显变化，乳酸脱氢酶 (LDH)和丙二醛(MDA)升高、腺嘌呤核苷三磷酸 (ATP)和谷胱甘肽(GSH)水平下降。并存在一定的剂量依赖。结果表明苍术苷可引起一定的肝毒性［10］。

杨哲琼等将 0.1、0.5、2.5 mmol/L浓度的氯化镉(CdCl2)与肝切片共培养2 h后发现，在各剂量组均出现LDH漏出率增加、MTT还原量减少、一氧化氮 (NO)的分泌量增加，显示肝细胞膜的完整性被破坏，抗氧化能力减弱，出现肝损伤。在2.5 mmol/L浓度的 CdCl2下与对照组相比，CYP水平和CYP3A4活性分别降低了47.6%、66.0%，葡萄糖醛酸转移酶-1(UDPGT-1)、葡萄糖醛酸转移酶-2(UDPGT-2)和谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)分别比对照组下降了50.0%、35.6%、22.6%。表明CdCl2抑制肝脏的解毒功能从而使肝损伤更加严重［11］。回连强等将野百合碱0.02、0.1、0.5 g/L与肝切片共培养24 h后，与对照组相比LDH漏出率显著上升，蛋白量显著下降，提示野百合碱具有一定的肝毒性［12］。

张春等尝试用肝切片技术进行药物对肝毒性保护作用的研究。当50 mmol/L乙醇与肝切片共孵育发现培养液中ALT、AST、LDH水平升高，显示在该浓度下乙醇可导致一定的肝损伤;肝切片的组织匀浆检测发现CYP2E1的标志酶-苯胺羟化酶 (ANH)活性升高提示高浓度乙醇能显著诱导CYP2E1活性。在将乙醇与463、694、1 388 nmol/L浓度的阿魏酸钠共培养后发现，随着阿魏素钠浓度的升高培养基中ALT、AST、LDH浓度可明显降低甚至回复到正常水平，并且ANH的活性也恢复正常。因此，在乙醇性肝损伤病理状态下，阿魏素钠不仅能提高损伤肝脏的抗氧化酶系活性，还能通过改变乙醇在肝脏的代谢途径，使其由CYP2E1主导的毒性较大的病理性代谢途径转到毒性较小、更接近生理状态下的代谢途径，从而保护肝脏［13］。在对乙醇的主要毒性代谢产物—乙醛的毒性研究中，Guoyu等发现0.5、1、2 mmol/L浓度的阿魏素钠可以有效的降低GST和丙二醛 (MDA)的浓度、抑制转化生长因子－β1(TGF-β1)的表达抑制从而抑制乙醛所致的肝毒性［14］。

2.3 研究动物种属差异对药物代谢及毒性的影响 此外肝脏是哺乳类动物主要的外源性物质的代谢器官，也是最容易成为外源性物质毒性的靶器官。不同种属的动物对外源性物质的代谢途径也不尽相同，故同一药物对不同种属的动物可能造成不同的毒性反应。

香豆素类药物是一类口服抗凝药，近年来发现其在不同的种属的实验动物体内代谢途径不一致。Steensma等对7-乙氧基香豆素和 ［3-14C］香豆素在小鼠、大鼠、豚鼠、食蟹猴和人的肝切片的代谢进行研究。发现7-乙氧基香豆素在上述五个种属动物的肝切片都与D-葡萄糖酸和硫酸盐共轭产生7-羟基香豆素。然而在小鼠和大鼠的肝切片上与硫酸盐共轭结合的几率远大于与D-葡萄糖酸结合。此外香豆素在以上五种动物的肝切片的代谢中也存在一定的异差。在食蟹猴和人的肝切片中香豆素主要与D-葡萄糖酸和硫酸盐共轭产生7-羟基香豆素，小鼠的肝切片中主要产物是3-羟基化通路产物和未知产物，大鼠肝切片中主要是7-羟基香豆素、3羟基化通路产物和未知产物，而豚鼠中的主要产物为7-羟基香豆素和未知产物［15］。

将烯丙醇、甲基萘醌分别与大鼠、豚鼠、猴、人的肝切片共培养，并通过检测蛋白质合成总量、K+浓度、MTT实验比较不同药物对不同种属动物的毒性表现。结果显示烯丙醇和甲基萘醌对四种动物的肝切片都可以引起明显的肝毒性，使蛋白质合成减少、K+浓度降低、细胞坏死。但相较于与其它动物，大鼠对烯丙醇的敏感性要弱，在高浓度下才产生明显的肝毒性［16］。Amin等将能够导致肝胆损伤的药物α-萘异硫氰酸 (ANIT)与大鼠或犬的肝切片共培养后发现，在大鼠和犬肝切片的培养基中都可检测到ALT、AST、ALP的水平显著升高，但在大鼠肝切片中可出现比犬肝切片更明显的炎症因子和氧化指标的变化［17］。

2.4 对肝纤维化的研究 肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程，肝星状细胞的激活是引起肝纤维化的主要因素［18］。

Guyot等将对乙酰氨基酚与肝切片共培养，发现经过48 h后，出现围绕小叶中央静脉的肝细胞坏死，并且在这些区域血小板衍生因子β受体上升，提示了肝星状细胞的活化。将N-乙酰半胱氨酸和对乙酰氨基酚共同加入培养基培养48 h后发现，未出现小叶中央静脉周围肝细胞的坏死和肝星状细胞的活化［19］。Schaffert通过大鼠肝切片技术，将乙醇与肝切片共培养，结果显示在24 h时细胞内GSH水平下降、脂质过氧化水平升高、白介素-6呈持续的升高趋势，在48 h出现平滑肌肌动蛋白 (SMA)和胶原蛋白1α明显升高，提示纤维化反应的加剧［20］。

吲哚-3-原醇是葡萄糖蔓芹苷的前体，大量存在于十字花科类食用蔬菜如西兰花、卷心菜、甘蓝花中。利用小鼠肝切片，武晓茜等研究了吲哚-3-原醇对乙醛活化肝星状细胞的作用及其机制。研究中发现吲哚-3-原醇可不同程度的减少乙醛激活的肝星状细胞，并可明显降低乙醛升高的培养液中 GST、LDH活性和肝组织中 MDA和羟脯氨酸(Hyp)水平，并呈良好的浓度依赖性。吲哚-3-原醇给药组与乙醛对照组比较，培养液中TGF-β1水平降低，MMP-1/TIMP蛋白表达比值升高。表明吲哚-3-原醇能有效拮抗乙醛所致的肝星状细胞活化，其机制与降低细胞氧化应激和促进基质胶原降解有关［21］。

3 展望

在肝切片技术出现的早期，该方法由于当时技术的限制，并未得到广泛的应用。随着目前仪器的发展与切片技术的提高，近年来才逐渐为人所重视，并在药物代谢、毒理、肝纤维化等研究领域得到广泛的应用。在国内，该方法也逐渐被人们所熟知和应用，据文献报道，如张春、杨哲琼等通过应用肝切片的方法建立了相应的体外肝损伤和肝纤维化模型，在对药物毒理和肝纤维机制研究方面取得了较大进展［11-12，14］。

但这项技术尚有以下几个缺点需要解决和完善:(1)整个实验的操作过程较为复杂。需要提供一个更为简便、快速的制备肝切片的方法。(2)药物不容易渗透到切片的内部，有时难以像其他体外方法一样评价药物-药物的相互作用。(3)需要建立明确的标准以提高肝切片的质量。此外随着目前各种检测仪器的飞速发展，将肝切片与核磁共振、质谱、基因芯片等技术联合应用可以满足未来以高通量、快速、精确为特点的药物研究的需求［22-24］。相信随着肝切片技术的发展和完善，该技术将会得到更多的关注和应用。

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