牛支原体耐药性研究进展

孔令聪，张春艳，高云航，马红霞，3*

(1.吉林农业大学动物科技学院，长春130118;2.文登市张家产畜牧兽医工作站，山东文登 264407;3.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，长春130118)

牛支原体(Mycoplasma bovis，M.bovis)是能引起牛支原体肺炎和乳房炎的病原，于1961年首次从患有乳房炎的病牛中分离［1］，1976年被报道与牛呼吸系统疾病有关［2－3］。近年来，该病原在世界范围内呈快速传播态势［4－6］。辛九庆等［7］首次在我国从犊牛肺脏中分离得到牛支原体。继而，国内部分地区新从外地引进的肉牛均爆发了牛支原体肺炎，给我国畜牧养殖业造成了巨大的经济损失，引起了国家有关部门的高度重视［8－10］。

由于M.bovis不具有细胞壁，因此β－内酰胺类对其治疗无效。此外，由于近年来抗生素的广泛使用，其持续的选择耐药性压力使M.bovis逐渐出现了耐药株，且耐药率高，范围广，呈多重耐药，其产生耐药性的直接后果不仅给控制和治疗该病带来困难，而且加剧了抗生素在牛体内的残留，因而，牛支原体的耐药尤其是多重耐药问题已经引起了人们的广泛关注［11］。

1 M.bovis的耐药性研究

目前，仅有美国具有商业化的疫苗用于预防牛支原体的感染，而其它国家均采用抗菌药物进行治疗［12］。牛支原体耐药而导致的临床抗感染失败已屡见不鲜，为此，越来越多的临床工作者积极开展了牛支原体耐药性检测的相关研究。

1.1 国外部分地区对M.bovis的耐药性研究 Ayling R D等［12］报道对在英国分离的62株 M.bovis进行了耐药性检测，其结果表明，20%的菌株对土霉素、壮观霉素、氟苯尼考耐药，98%的菌株对替米考星耐药，仅部分菌株对达氟沙星敏感［12］。Laak E T等［13］对临床分离株进行了体外抑菌试验，结果显示，所有受试菌株对泰乐菌素、吉他霉素、硫姆林敏感;对硝呋喹酸、土霉素、链霉素、金霉素中度敏感，对多西霉素、米诺霉素耐药。Ricardo F R等［14］对临床分离的233株牛支原体进行了抑菌试验并测定其最低抑菌浓度(MIC)值，结果显示，60%菌株对大观霉素和氯四环素耐药，对替米考星已高度耐药，其MIC＞128 μg/mL 的菌株占 60%。Uemura R等［15］报道，从日本本地牛和澳大利亚进口的牛中分离得到88株M.bovis，并采用13种抗微生物药物对其进行了耐药性分析，结果表明，从日本本地牛分离的菌株对大环内酯类、四环素类、甲砜霉素、氟甲喹、卡那霉素、林可霉素、氟霉素高度耐药，对大观霉素、氟喹诺酮类敏感，从澳大利亚牛分离的菌株对红霉素、甲砜霉素高度耐药。Marty S等［16］对在美国分离的192株牛支原体进行了耐药性检测，并用细胞流式计数器对其结果进行分析，结果显示，所分离菌株对大观霉素、头孢噻呋高度耐药，对氟苯尼考、恩诺沙星、四环素等药物相对敏感，其在牛乳中分离的菌株比在肺脏中分离的菌株耐药程度稍高。

1.2 国内部分地区对M.bovis的耐药性研究 闫凤英等［17］对临床分离的M.bovis进行了耐药性检测，结果表明，大部分菌株对放线菌素D、丝裂霉素中度敏感，对红霉素、链霉素、多粘霉素高度耐药。笔者所在研究室自2010年以来从我国部分地区分得4株M.bovis，并对其进行耐药性检测，结果显示，所有菌株均对氟苯尼考和环丙沙星呈现相对耐药，其MIC为16μg/mL和8μg/mL，对替米考星相对敏感，其MIC ≦2μg/mL。

综上所述，不同国家和地区分离的M.bovis，对常用的各种抗生素均显示出不同程度的耐药性，且兽医临床使用频率较高的抗生素，其产生的耐药性较高。此外，M.bovis的耐药性存在着一定的地域差异性，这可能与不同国家和地区在动物治疗中所使用或在饲料中添加的抗生素的种类以及使用方法、对药物的用量标准不同有关，从而造成了不同国家和地区M.bovis的耐药性有所差异。

2 支原体的相关耐药机制研究现状

目前，牛支原体耐药机制的研究还很少见，为此，本文对牛支原体和与他同源关系较近的肺炎支原体和人型支原体耐药机制的研究现状做以综述，以期为牛支原体耐药机制的研究提供参考。

2.1 M.bovis耐药机制研究现状 相关研究证明M.bovis对喹诺酮类抗生素的耐药机制与其他微生物类似，其发生 gyrA、gyrB、parE、parC基因的突变，是介导其产生对喹诺酮类药物产生抗性的主要机制。Shabat M等［17］在对42株牛支原体进行耐药性检测的同时，也对其喹诺酮耐药决定区的碱基进行了测序分析，其结果显示，parC耐药决定区第265位发生了G→A的碱基突变(符合大肠埃希氏菌QRDR区突变规律)，并通过SNP－RT－PCR建立了快速检测基因突变的方法，既简单又快速的检测出耐药株，进而降低临床用药成本。

2.2 肺炎支原体的耐药机制研究现状 Atsuoka M等［18］在日本的三个地区分离到76株肺炎支原体，并筛选到13株对大环内酯类抗生素高度耐药的菌株(MIC均大于256 μg/mL)，其中，10株菌在核糖体23SrRNA的2063位发生由A→G的点突变，1株在2063为发生A→C的点突变，1株在2064位发生A→G的点突变。Pereyre S等［19］通过在亚抑菌浓度中连续传代的方法将肺炎支原体敏感株诱导成为耐药株，并对其23SrRNA结构域Ⅴ和Ⅱ进行测序分析，结果显示，耐药株23SrRNA结构域Ⅴ中心环发生了2611位由C→A的点突变和2062位A→G的点突变，同时核糖体蛋白L4、L22亦发生了改变，所有耐药株的23SrRNA结构域Ⅱ均未发生碱基突变。在我国，辛德莉等［20］从临床分离得到4株对红霉素耐药的肺炎支原体，并首次对支原体的耐药机制进行了研究，对其23SrRNA基因序列比对后发现，两株在结构域Ⅴ发生了2063位A→G的点突变，另外两株发生了2064位A→G的的点突变。Yun Y等［21］对临床分离耐大环内脂类抗生素的18株肺炎支原体的耐药机制进行研究，结果显示，其耐药株的23SrRNA不但发生了2063位A→G和2064位A→G的点突变，还发生了2617位C→G和2067位A→G的点突变，并进一步证明其2063位靶位突变介导了14元大环内酯类药物耐药，2064位靶位突变介导了14和16元大环内脂类耐药，2617位靶位突变介导了14和15元大环内脂类耐药，此外，2067位靶位突变与支原体对交沙霉素耐药有关。

此外，随着对大环内酯类抗生素耐药机制研究的深入，外排泵的作用得到了高度的重视，mefA、mefE、mreA等基因编码的外排泵蛋白能提供对14元、15元大环内酯类的抗性，进而导致细胞内抗生素的浓度降低，但支原体是否也存在其类似的机制，目前还未见相关报道［22］。

2.3 人型支原体的耐药机制研究现状 Robertson等［23］在对人型支原体进行耐药性检测的同时，运用斑点杂交技术对其耐药基因进行了检测，结果表明，人型支原体存在四环素抗性决定子(Tetracycline resistance determinant，tetM)，支原体对四环素类抗生素产生抗性，主要是通过tetM基因转移而产生的，tetM广泛存在于细菌中，其基因序列位于质粒上，可编码639个氨基酸的蛋白质，该蛋白不但能与核糖体结合，阻止四环素附着于30S亚基，还能保护核糖体，不受四环素类抗生素的抑制，从而使其对四环素类抗生素产生抗性。但M.bovis对四环素的耐药性是否也与tetM基因有关，还未见相关报道。

此外，与支原体亲缘关系较近的金黄色葡萄球菌对喹诺酮的耐药机制已有阐明，其主要是药物的主动外排系统(efflux system)，其为norA编码的多肽，含388个氨基酸，norA引起的喹诺酮类耐药程度与药物的亲水性强弱有关［24－25］。

3 问题与展望

目前，作用于核蛋白体的大环内酯类、喹诺酮类和四环素类抗生素仍是兽医临床治疗M.bovis的首选药，但随着药物选择压力的持续促使M.bovis耐药株逐渐产生，不但使其导致的肺炎、乳房炎的治疗成本不断增加，而且加剧了抗生素在牛体内的残留。经国内外学者研究证实，肺炎支原体和人型支原体的耐药机制主要与药物靶位的突变和质粒携带耐药基因的表达等因素有关［26］，是否同样的机制也发生在M.bovis上，尚未见相关报道。为此，研究 M.bovis的耐药性和耐药机制，寻求有效的治疗方案病并设法寻求解决M.bovis耐药的方法，将为促进养牛业健康持续发展和保障食品安全奠定基础。

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