乙酰肝素酶在肿瘤中的表达及其调控

李 阳，刘 浩，蒋志文

(蚌埠医学院药学系，安徽省生化药物工程技术研究中心，安徽蚌埠 233000)

硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparin sulfate proglycan，HSPG)是细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)的重要组成部分，也可作为受体迅速结合生长因子、趋化因子、酶等近百个不同的蛋白质。他由一个核心蛋白与多个线性硫酸乙酰肝素(heparin sulfate，HS)侧链共价连接而成，其HS侧链带有负电荷具有高度活性，是HSPG的活性关键部位。乙酰肝素酶(heparanase，Hpa)是哺乳动物体内唯一能切割ECM中HS侧链的内切性糖苷酶，这也是Hpa影响很多生理病理过程的原因。Hpa可以影响骨、血管、毛发等形成和生长，对肿瘤的生长分化、侵袭转移也有着重要作用，在多种恶性肿瘤中Hpa的高表达高活性状态表明其可能成为一个抗肿瘤治疗的新靶点［1－2］。本文通过对Hpa在肿瘤中的表达及调控进行综述，以期为以Hpa为靶点的肿瘤治疗尤其是肿瘤转移的治疗提供一定的理论依据。

1 Hpa的生物学功能

Hpa发现于1999年，是一个内源性β2葡萄糖醛酸酯酶，能特异性识别并剪切HS侧链。研究发现人类Hpa有两种亚型，Hpa1与Hpa2。由于分布和功能不同，目前在肿瘤的研究中主要以Hpa1为主，它是由两条多肽链以非共价键方式结合而成的异二聚体。在正常组织中，Hpa1 mRNA在胎盘之外的成熟非免疫组织中均不表达，但在恶性肿瘤细胞中普遍高表达。

在人类胎盘中，Hpa的两种转录子都呈现高表达，尤其在滋养层细胞溶解物中活性很高，这可能是Hpa促进血管新生和滋养层细胞侵袭基底膜(basement membrane，BM)的重要因素。Hpa活性降低后，结合的各种物质作用均受到抑制，滋养层细胞的分裂减速。血管生成涉及了生长因子、ECM、粘附受体分子及基质降解酶等一系列的因素，HSPG作为血管的重要组成部分［3］，这为Hpa影响血管生成、滋养层细胞的浸润奠定了物质基础。在增生的人类内皮细胞、皮肤和创面肉芽组织中发现，Hpa高表达刺激了角质细胞迁移，加强了伤口上皮细胞和血管的成熟，明显提高了皮瓣成活，说明Hpa在伤口愈合处介导增强皮肤的血管生成［4］并使组织修复加速。而在肿瘤进展的方面，Hpa对HS侧链的切割可以破坏BM和ECM，释放其中的生长因子，进而促进肿瘤侵袭转移和血管生成。

2 肿瘤细胞中Hpa的表达和调控

Hpa在转移的恶性肿瘤细胞中普遍高表达，其促进肿瘤转移的机制是目前研究热点［5－6］之一，涉及到多因素多过程，除酶活性启动通路，AKT、Rac1、Src磷酸化及碱性成纤维细胞生长因子等均参与其中。肿瘤细胞中Hpa表达与多种因素有关，包括外源环境和细胞因子等内源因素的影响。

2.1 内质网应激调控 细胞在缺氧、营养缺乏、糖基化抑制、化疗药物、氧化应激等多种因素作用下，均会引起内质网应激，使内质网功能紊乱，未折叠蛋白或错误折叠蛋白堆积。其中由蛋白质堆积所引起蛋白质合成减少、内质网降解功能增强等后续反应，称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。UPR是一种复杂的信号转导级联反应，能够限制非折叠蛋白的累积，最初效应是保护内质网，限制其他细胞器的损害，通过减少细胞的过度应激而保护机体［7］。UPR提高细胞在有害因素下的生存能力，但未折叠的蛋白长时间积聚在内质网便会对细胞产生毒性，当UPR信号通路不能缓解内质网应激状态时便会启动细胞凋亡程序［7］。因此，内质网应激最终方向是不利于细胞生存的，可在这过程中UPR的激活又使肿瘤细胞得以存活，肿瘤向更恶性的方向发展。研究发现［8］，内质网应激的标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulatedprotein，GRP78)升高能够促进肝癌细胞侵袭转移，而在本实验室的研究中，我们发现内质网应激状态能够促进乳腺癌细胞离开原来的应激环境，通过加速肿瘤细胞侵袭转移使其得以生存，而这与UPR激活Hpa有着密切联系，其具体机制尚需进一步研究。

2.1.1 缺氧及pH 肿瘤缺氧时，UPR使肿瘤适应低氧环境，ATP生成减少，而蛋白质的折叠是ATP依赖的过程，能量不足会影响蛋白质折叠，这些因素都使得未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔内积聚，加重内质网应激。处于缺氧状态的肿瘤细胞仍能不断增殖、浸润，在这个过程中低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)起着重要的作用。HIF-1是广泛存在于肿瘤中的转录因子，也是肿瘤微环境缺氧的重要标志物之一。在恶性肿瘤生长过程中，由于组织增生过快必然会造成局部组织严重缺氧，HIF-1蛋白水平增加，加强肿瘤细胞代谢的适应性，促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等血管生成基因的转录［9］，继而促进肿瘤的侵袭转移。研究发现［10］，在正常组织中Hpa仅在胚胎和淋巴结中高表达，其活性也多处于失活状态，而在大部分易侵袭转移的缺氧恶性肿瘤中Hpa表现为高表达高活性状态，缺氧可以激活Hpa，这提示我们缺氧因子参与了肿瘤细胞中Hpa表达过程或参与了对其活性的调控。

Hpa仅在pH 4.0-7.5的酸性环境中发挥作用，其最佳表达活性是在pH 5.5-5.8之间，pH值越高其活性越低。肿瘤中心部位缺血缺氧都将为Hpa提供一个适宜的酸性环境，使其发挥酶的最大降解活性。如果pH大于8.0 Hpa就会失去活性，但仍拥有黏附作用。失活的Hpa和ECM中的HS结合，可作为内切糖苷酶的储库，以便炎症时能马上降解ECM和BM，便于白细胞向血管外和基质中游走。因此，局部组织的pH能够调节Hpa的表达及活性［11］。

2.1.2 放疗及药物调控 放疗对Hpa有着重要的影响，在治疗胰腺癌的过程中发现临床相关剂量的电离辐射(Infrared，IR)能上调Hpa的表达，从而增加胰腺癌的转移［12］。放疗和化疗药物可以激活内质网应激，IR单独运用于胰腺癌治疗时，可能会通过激活UPR和Hpa而促进肿瘤细胞侵袭转移。结合了Hpa抑制剂后能够抵消IR增强胰腺癌细胞体外侵袭的作用，减少原位胰腺肿瘤在体内的扩散，对防止肿瘤细胞侵袭转移是一种有效策略。

Hpa的底物HSPG具有2个结构特点，即含硫酸基团和糖链，并带负电荷，故凡具备上述特点的生物或化学物质均有可能抑制Hpa活性。Hpa抑制剂分为三类，HS类似物、活性抑制剂和植物多糖。由于肝素或低分子量肝素等抗凝剂有出血等并发症，其用于肿瘤治疗受到限制。但将抗凝和抗Hpa的属性分开后，通过化学修饰得到了一系列的HS类似物，在高剂量时无风险，可以作为潜在的抗血管生成和抗转移药物，如低分子量肝素、SST001和 PG545。PI-88［13］是含硫酸基的寡糖，由低聚糖磷酸盐经磺化作用而生成。PI-88一方面可以直接抑制Hpa的活性，同时它又通过阻抗血管生成因子及其受体与HS的相互作用，刺激凝血激酶途径阻滞剂的释放，从而产生抗血管生成的作用，达到抗肿瘤的目的。OGS 通过高通量筛选，发现 2，3-二氢-1，3-二氧-1H-异吲哚-5-羧酸化合物具有抑制Hpa活性的作用，在此基础上进行衍生物合成，获得的一系列小分子抑制剂，OGT2115作为其中最具有效果的一种，分子式为C24H16BrFN2O4，在体外实验中体现了很强的抗Hpa活性。寡聚的硫酸甘露糖醛酸(oligomannurarate sulfate，JG3)作为Hpa抑制剂的一种，在体内外都有良好的抑制肿瘤转移作用［14］。它与Hpa的相互作用受到低分子量的肝素的竞争，但不受其他黏多糖的影响。此外，这种化合物可以通过抑制碱性成纤维细胞生长因子b-FGF从ECM中的释放，抑制血管生成。

2.2 内源因子调控

2.2.1 细胞因子和酶 Hpa可被一些蛋白酶，如胰蛋白酶和尿激酶等灭活，在炎症发生以及肿瘤细胞转移时，机体会大量分泌免疫因子，刺激细胞分泌Hpa，使细胞获得在ECM中游走的能力。肿瘤坏死因子TNF-α，γ-干扰素和脂肪酸可以使内皮细胞分泌Hpa蛋白增加，VEGF可使其分泌降低。b-FGF是一种强有力的血管生成因子，具有结合肝素的特性，Hpa与b-FGF在肝癌、胰腺癌、肺癌、胃癌等组织中均呈高表达且成正相关，说明它们在促进肿瘤细胞扩散转移、血管生成中发挥重要的协同作用。而早期在黑色素瘤B16细胞和T细胞淋巴瘤的研究中［15］，Hpa促进肿瘤的侵袭转移与基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)也密切相关。MMPs作为肿瘤微环境的重要组成部分，增强Hpa的表达可以导致MMP-9增强，Hpa基因沉默后导致 MMP-9失活。Hpa的激活同时也决定了其他MMPs的活化，尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和其受体(uPAR)也均会响应，这些研究结果首次提供了Hpa和MMPs之间合作调节细胞表面和ECM中的HSPGs的证据。

2.2.2 上皮细胞间质转型(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)EMT是具有极性的上皮细胞转换成为具有活动能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程，它存在于人体多个生理和病理过程中。EMT的发生涉及到多个信号转导通路和复杂的分子机制，并与肿瘤细胞的侵袭转移关系密切。在肾病疾病末期时，EMT参与肾间质成纤维化并在近端肾小管上皮细胞转化成肌纤维母细胞中有着重要作用。FGF-2在肾小管上皮细胞中诱导了EMT的出现，并与Syndecan-1相关。Syndecan-1是跨膜HSPG家族成员之一，表达于大多数上皮细胞，在不同的细胞类型和发育阶段表达均有不同。Syndecan-1在多种肿瘤细胞中的表达下降，与肿瘤细胞的生长、分化、转移过程密切相关，可作为判断多种肿瘤预后的指标。研究发现，Hpa对HS/Syndecans正确转变是至关重要的，一个错误的HS/Syndecans调控会妨碍FGF-2的活性。虽然FGF-2在野生型细胞株中诱导EMT，但它对Hpa沉默细胞是无效的，因此Hpa在肾小管上皮细胞中对诱导EMT是必要的。Hpa与EMT在肿瘤的侵袭转移过程中是协同作用，FGF-2诱导的EMT通过PI3K/AKT通道，降解Syndecan-1，增加Hpa和MMP-9的表达［16］。而本实验室的研究发现，化疗药物激活了内质网应激后Hpa的表达增加，且同时可诱导出现EMT，二者是否协同影响了肿瘤细胞的侵袭转移仍需要进一步研究。

2.3 基因调控

2.3.1 启动子甲基化和抑癌基因p53DNA甲基化是Hpa活性的重要抑制因素，DNA去甲基化可上调Hpa基因的表达。前列腺癌组织与正常组织相比，启动子甲基化水平较低，但Hpa的表达及活性均偏高。恶性组织中甲基化调控Hpa这一过程被干扰，Hpa启动子基因表达增加，造成了肿瘤转移和血管新生。p53基因是一种转录因子，是细胞凋亡的重要调控基因，分为野生型和突变型。野生型p53基因是一种抑癌基因，可限制多种应激因素引起的过度细胞生长，如DNA损伤、癌基因的活化、组织缺氧等。野生型p53被去除或活性抑制后均可导致Hpa表达和活性的明显增高，这是由于野生p53结合Hpa启动子并抑制其活性，而p53基因突变后就不能发挥此种抑制作用［17］。

2.3.2 MicroRNA MicroRNAs(miRNAs)是一类保守的非编码单链RNA，约8－25个核苷酸，通过与靶基因mRNA互补位点的结合在转录后水平调控靶基因的表达。miRNAs直接作用于约30%的人类基因，而且几乎参与所有的生物过程，最近研究发现肿瘤中miRNAs的表达失调参与了肿瘤转移。CascioS［18］等通过模拟MCF-7乳腺癌细胞低氧环境，发现miR-20b能够通过调节HIF-1及STAT-3通路从而下调VEGF的表达，抑制肿瘤细胞的增殖和转移，起到抑癌基因的作用。而在脑转移性乳腺癌中，miRNAs的引入对Hpa的表达起着增加或抑制的作用。miR-1258的水平与Hpa相关表达成反比，而各种浸润型肿瘤的实验中也验证了这个结果，这说明miR-1258是通过调控Hpa的表达而起作用，这为以Hpa为靶点治疗提供了分子依据［19］。

2.3.3 其它 Ets启动子家族参与了Hpa mRNA在癌细胞中的表达，Ets1、Ets2有激活恶性乳腺癌细胞Hpa基因的功能，Ets成员之一GA结合蛋白需要和Sp1结合，共同调控甲状腺肿瘤细胞Hpa转录。研究发现早期生长反应基因-1能影响Hpa的表达和活性，且在不同类型肿瘤中通过不同的机制调控Hpa的表达。早期生长反应基因-1是具有锌指结构的转录因子家族成员之一，早期即可对多种信号产生反应而增加表达，从而调节Hpa1的转录。NF-κB作为细胞内较为下游的转录因子，参与了多条信号途径，而在肿瘤细胞中也可调控Hpa1的表达。抑制NF-κB可以下调MMP-9、纤溶酶原激活物和Hpa1，从而阻止了自发性肿瘤转移。结肠癌细胞中真核细胞起始因子24E(eukaryotic initiation factor24E，eIF24E)被抑制后，Hpa的活性和表达均下降，并伴有癌细胞体外侵袭力的下降，这在LS-174T细胞中已被报道［20］。

3 展望

Hpa在肿瘤发生发展的各个阶段中均有表达，其促进肿瘤侵袭转移的作用被阐明后，为人们治疗肿瘤转移提供了新的思路。近年来以Hpa为靶点的药物研发也取得了一些重要的进展，尤其是HS类似物的临床研究［21］。此外，来自人Hpa的多肽可以引出一个对自体淋巴细胞没有杀伤作用的抗肿瘤免疫反应，这为以Hpa为基础的肿瘤免疫治疗也奠定了基础。由于Hpa在肿瘤组织中的重要性，研究Hpa在肿瘤中的表达调控及其机制对肿瘤的治疗尤其是在侵袭转移方面有着重大的意义。

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