新城疫病毒载体的应用研究进展

谢金文，沈 旭，林初文，沈志强

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的多种禽类易感的一种急性、高度接触性、毁灭性传染病，也是目前严重危害我国养禽业的重要疫病之一。

1 反向遗传学

反向遗传学（reverse genetics）是相对经典遗传学而言的。经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律，而反向遗传学与经典遗传学的研究思路正好相反，是直接从生物遗传物质入手，通过对遗传物质进行加工和修饰来研究基因突变后产生的生物体的特性（表型和性状等），从而确定生物体基因组的结构与功能以及这些突变可能对生物体特性的影响。与之相关的各种研究技术统称为反向遗传学技术（reverse genetics manipulation technique）［1－3］，主 要 包 括 RNA 干 扰（RNA interference，RNAi）技术、基因沉默技术、基因体外转录技术等，是DNA重组技术应用范围的扩展与延伸。目前，该技术已广泛应用于生命科学的各个研究领域，RNA病毒研究的快速发展正得益于此［4－7］。该方法不仅能够研究病毒基因的功能，而且可以用病毒表达外源基因。

2 病毒载体

病毒载体（virus vector）是利用重组DNA技术将外源基因插入经过改造的病毒基因组内部，而后感染细胞，使外源基因在细胞内得到有效表达。病毒载体作为一种常用于分子生物学的工具，多应用于基础研究、疫苗研究和基因治疗等方向。随着反向遗传学技术的发展，催生出了许多RNA病毒载体，如新城疫病毒（NDV）载体等。随着反向遗传学操作技术的发展，越来越多的RNA病毒成为病毒载体的研究对象。

3 重组NDV作为活病毒载体疫苗的优点

重组NDV作为活病毒载体疫苗具有极为突出的优点：NDV弱毒疫苗长期以来一直用于家禽防疫，其安全有效性已被充分证明。NDV弱毒苗可同时诱导全身性体液免疫、局部黏膜免疫及细胞免疫的形成，产生更加全面、确实的保护。NDV可在体内增殖并长期表达抗原基因，因此可以诱导持久的保护作用。NDV疫苗可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式给苗，使用极为方便。NDV弱毒具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本低廉。NDV遗传相对稳定，仅有一个血清型，毒株间发生重组及毒力返强可能性很小。复制过程在胞浆内完成，从RNA到RNA，不存在DNA阶段，故其基因组不会与宿主细胞DNA整合，没有人工转基因的风险。NDV不能在人的正常细胞中复制，对人一般没有感染性，即使是感染了野生型NDV也只是引起轻微的疾病。一般认为，NDV尤其是弱毒株对人类是安全的。因为上述诸多优点，NDV作为病毒载体的应用研究也受到了越来越多的关注［8－9］。本文即对新城疫病毒反向遗传载体的应用进展作一综述。

4 新城疫病毒载体的应用

早在2000年，Krishnamurphy等［10］即首次将氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）插人到中等毒力毒株Beaudette C株HN基因和L基因之间的间隔区构建重组病毒。与亲本株野生病毒相比，该重组病毒在鸡胚成纤维细胞（CEF）上的复制速度和产量均有所下降，但是该重组病毒在CEF上能稳定表达CAT活性8代以上，首次证明NDV可以作为外源基因的表达载体。

2001年，Nakaya T等［11］把流感病毒（Avian influenza viruses，AIV）A／WSN／33株的 HA 基因插入到NDV弱毒株Hitchner B1基因组的P基因和M基因之间，获得了含有流感病毒HA基因的重组新城疫病毒rNDV／B1－HA。rNDV／B1－HA在鸡胚连续传10代后仍能稳定地表达流感HA蛋白，并且重组病毒已经致弱。动物实验显示重组rNDV／B1－HA对小鼠没有毒性，小鼠免疫重组病毒后，能够检测到针对流感病毒HA的高滴度抗体，并且免疫小鼠能够抵抗致死剂量流感病毒A／WSN／33的攻击。该年，Huang等［12］将CAT基因插入 NDV La Sota株基因组的3′远端紧靠NP基因位置，获得含有CAT基因的重组新城疫病毒rLa Sota／CAT。连续传代12次，该重组病毒仍能高水平的表达外源基因CAT，表达的CAT的活性是2000年Krishnamurphy等［10］构建的重组病毒rNDV／BC／CAT表达的CAT活性的11倍。

2002年，Mebatsion等［13］运用反向遗传学成功获得了缺乏NP基因优势免疫抗原表位（IDE）的NDV。鼠肝炎病毒（MHV）S2糖蛋白的一个B细胞抗原表位插入到NP蛋白中来替代NP－IDE，表达MHV的重组病毒被成功的生成，用重组病毒免疫的雏鸡能够产生MHV S2糖蛋白的特异性抗体。因此，在NP基因的可突变区插入保护性表位构建标记疫苗，有助于在临床上对NDV进行鉴别诊断。

2003年，Engel－Herbert等［14］把绿色荧光蛋白（GFP）基因插入新城疫病毒Clone 30毒株基因组的F基因和HN基因之间，获得了重组病毒rNDV／GFP1。rNDV／GFP1在鸡胚中可稳定地表达GFP，并且其在鸡胚中的增殖能力以及对鸡胚的致病性与母本Clone 30毒株没有明显的区别。利用GFP的自发荧光特性，可以很容易的在器官和组织中发现感染的细胞，因此能够更清楚地了解NDV在体内的分布和致病性等情况，显示了NDV作为疫苗载体的巨大潜力。同年，Zhao等［15］对NDV作为载体的可行性进行了深入研究。他们将人的分泌型碱性磷酸酶（SEAP）基团作为报告基因，分别插入NDV基因组的 NP－P、M－F、HN－L、基因组5′端，结果实验中获得的重组病毒都能够不同程度地表达SEAP基因。

SEAP被插入的前3个位置，无论是在细胞上还是在鸡胚上都能得到高效表达，3者之间的表达水平相当，且活性不受影响；而插入基因组5′端这个位置的重组病毒对SEAP基因的表达量则低了不少。从外源基因插入NDV的位置来看，其插入位置越接近NDV基因组的3′末端，其病毒蛋白表达水平有可能越高。实验为以NDV为疫苗载体，插入一个或多个外源基因，构建多价疫苗提供了更多的插入位点的选择。

2004年，Huang等［16］又将鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）变异株GLS－5的VP2基因插入到体内复制能力较强、免疫原性良好的NDV La Sota疫苗株基因组的3′端，拯救出能够表达VP2蛋白的重组新城疫病毒rLa Sota／VP2。该重组病毒在鸡胚上连续传12代均可保持遗传性状的稳定和表达VP2蛋白，且VP2蛋白不整合到重组病毒粒子中；利用该重组株免疫2日龄SPF雏鸡21d后，90%以上可有效抵御IBDV变异株GS－5及新城疫强毒Texas GB的攻击；加强免疫后则可100%的保护。Nakaya等［17］利用反向遗传技术，将猴免疫缺陷症病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）病毒的 Gag蛋白在NDV中进行了表达，发现拯救的重组病毒可诱导针对Gag蛋白的特异性细胞免疫反应。进一步研究发现，当用表达SIV Gag蛋白免疫原部分的重组AIV加强免疫后，则激发更强的免疫反应，表明重组的NDV或AIV可作为预防爱滋病（AIDS）或其他传染病的候选疫苗。

2005年，Bukreyev A 等［18］将人Ⅲ 型副流感病毒HN基因插入NDV基因组的P基因与M基因之间，获得重组新城疫病毒。动物实验表明，免疫该重组病毒的试验动物可产生针对副流感病毒HN蛋白的较高的抗体水平，能够获得较好的免疫效果。

2006年，南京农业大学葛金英等［19］把表达野生型和突变型H5亚型高致病性禽流感HA基因插入到NDV La Sota株基因组的P基因和 M基因之间，获得了含有禽流感病毒HA基因的重组新城疫病毒rLa Sota－HAmut。将rLa Sota－HAmut株和NDV La Sota株，感染CEF后收取细胞液，接种10日龄SPF鸡胚，La Sota－HA株接种鸡胚内达到与亲本La Sota疫苗株相似的生长滴度，接种9－10日龄SPF鸡胚后120h内不致死鸡胚，并且免疫低日龄SPF鸡可诱导高水平的NDV和H5N1亚型AIV特异保护性抗体反应，显示该疫苗株作为活病毒载体疫苗具有高度安全、鸡胚生长适应性及良好的免疫原性。同年，Man等［20］以 NDV B1株为载体，构建了能够表达H7亚型禽流感病毒的HA蛋白的重组新城疫病毒，用该重组病毒免疫的鸡可同时获得抵抗NDV强毒和H7AIV的能力：免疫后的雏鸡可以完全抵抗NDV强毒的攻击，对H7N7高致病性AIV也有90%的保护率。Veits等［21］构建了表达AIV H5亚型HA的NDV。在Clone 30株NDV F基因和HN基因之间插入高致病性禽流感 A／chicken／Italy／8／98 株 （H5N2 型 ）HA 的ORF，记为NDVH5。然后在 NDVH5的基础上NDV HA ORF内的转录终止信号通过沉默突变被消除产生重组毒株NDVH5m。实验结果表明，与NDVH5进行对照，NDVH5m产生了2．7倍的全长HA转录本，表达了较高水平的HA，同时也使较多的HA蛋白进入病毒外膜。1日龄雏鸡脑内接种后，2种重组病毒均无毒。用NDVH5m免疫雏鸡后，再分别用致死剂量的velogenic型NDV或高致病性AIV进行攻毒，发现用NDVH5m诱导的NDV抗体和AIV抗体对雏鸡有很好的保护率，异常的是流感病毒的脱落没有被观测到。此外，用NDVH5m免疫接种，在血清学上可将禽流感疫苗接种产生的抗体与野毒感染产生的NP蛋白抗体相区别。因此，重组体NDVH5m可作为一个非常合适的二价疫苗候选毒株。

2007 年，Dinapoli等［22］将 高 致 病 性 禽 流 感（HPAIV）H5N1HA基因插入新城疫病毒基因组中，研制出一种可表达HPAIV H5N1HA蛋白的试验型弱毒疫苗，并将其直接接种呼吸道。研究表明：该疫苗可预防H5N1所带来的死亡和降低发病率，此外还可诱导大量的黏膜免疫球蛋白A的反应。在呼吸道诱导局部免疫反应的最大特点是很可能在爆发或流行中减少或防止病毒传染。该重组新城疫病毒是一个疫苗候选株，可用于临床评价人类HPAIV疫苗。同年，Dinapoli等［23］还将与严重急性呼吸系统综合征相关的冠状病毒SARS－CoV的S蛋白插入NDV弱毒株的P－M位点，构建了重组新城疫病毒表达载体。通过呼吸道用2个剂量的疫苗免疫非洲绿猴，其产生的中和抗体效价相当于非洲绿猴免疫其他试验制备的SARSV疫苗并再用SARSV攻毒产生二次反应时的抗体效价。当动物免疫重组病毒并用高剂量的SARSV攻毒时，在病毒复制的高峰期直接检测肺组织病毒量，结果与对照组动物相比，免疫组动物肺部SARSV效价降低。证实其在灵长类动物中具有较好的免疫原性和保护性，是一种非常有潜力的疫苗载体。

2008年，葛金英等［24］又以La Sota株为载体，构建了表达超强毒vvIBDV GX分离株VP2基因的重组 La Sota疫苗株rLa Sota－VP2。重组疫苗株rLa Sota－VP2以106．0EID50一次免疫7 日龄 SPF雏鸡，免疫后3周对新城疫强毒致死攻击100%保护，对vvIBDV攻击免疫保护率达90%以上。重组病毒rLa Sota－VP2保持了La Sota亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性、高度生物安全性及遗传稳定性。为研制传染性法氏囊病－新城疫重组二联活载体疫苗奠定了基础。

2009年，胡顺林等［25］利用反向遗传技术将NDV强毒株ZJ1的F裂解位点序列进行改造，成功拯救 出 重组 毒 株 NDV／ZJ1HN。利 用 NDV／ZJ1HN免疫2周龄鸡，免疫后4周用基因Ⅶ型NDV强毒株进行攻毒可获得比传统疫苗La Sota株更好的免疫保护，提示NDV／ZJ1HN有可能作为一个理想候选疫苗株用于生产中对基因Ⅶ型NDV流行株的防控。同年，Nayak B等［26］将 H5N1亚型高致病 性禽 流感病 毒 A／Vietnam／1203／2004 的HA基因插入到NDV La Sota株中，获得了含有禽流感病毒HA基因的重组新城疫病毒rNDV－HA，用其免疫14日龄SPF鸡，免疫3周后对H5N1亚型禽流感病毒及新城疫强毒均具有较好的保护。陈化兰等［27］应用新城疫病毒为骨架的反向遗传学平台，得到表达H5N1亚型禽流感HA蛋白的重组病毒，动物实验表明，免疫鸡产生很强的抗体水平，能够对同型别和不同型别的H5N1病毒攻击产生保护力。

5 小 结

当前，利用反向遗传操作技术，以NDV作为疫苗载体的研究已经得到快速的发展。相信随着分子生物学各项技术的发展，NDV作为一种有效的病毒载体定会受到越来越多的关注、具有越来越广阔的应用前景。

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