禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

（宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心，宁夏 750011）

禽流感病毒呈世界性分布，绝大多数禽流感病毒呈隐性感染，不表现临床症状。只有少数禽流感病毒具有迅速传播和高致病性的特征。禽流感病毒H5、H7、H9亚型的致病性强，危害极大，现有的荧光PCR检测方法每次只能检测禽流感病毒单个亚型，费时费力，检测成本较高。更重要的是对于一批家禽及其产品，现有的单亚型检测并不能完全适应实际需要，迫切需要开发多种亚型禽流感病毒的快速检测方法。

1 实验材料与方法

1.1 病毒和鸡胚

1.1.1 禽流感病毒H5、H7和H9亚型标准抗原。

1.1.2 禽流感病毒H5、H7和H9亚型分离毒株，均由深圳出入境检验检疫局实验室于2004年禽流感暴发流行期间均购自哈尔滨兽医研究所。进行了相关的分离保存操作，其他的病毒都由深圳出入境检验检疫局的实验室保存。

1.2 一步法

RT-PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，设备与试剂 ABI7900HT荧光定量PCR仪，核酸蛋白分析仪。病毒RNA抽提试剂盒购自Qiagen公司。

1.3 探针和引物的合成与设计

1.4 抽提禽流感病毒RNA

1.5 禽流感H5、H7、H9双重实时荧光RT-PCR的建立

1.6 实时荧光RT-PCR的敏感性试验

1.7 实时荧光RT-PCR的特异性试验

1.8 三重实时荧光RT-PCR的干扰性试验

1.9 禽流感病毒三重实时荧光RT-PCR与HA、HI

1.10 禽流感病毒三重实时荧光RT-PCR的田间试验

2 实验结果

2.1 三重实时荧光RT-PCR敏感性试验

在三重实时荧光RT-PCR的反应体系中，将测定的体外转录的H5亚型的RNA只加入不同稀释度的H5模板，作10倍连续稀释。试验证实，三重实时荧光RT-PCR方法对H7和H9的敏感性分别约为1 000拷贝和500个拷贝。

同样，进行H5亚型的三重实时荧光敏感性检测，结果证实其检测的敏感性约为1 000个模板拷贝。

2.2 三重实时荧光RT-PCR的特异性试验

通过对多种感染鸡的病毒或细菌的检测，只加入在反应体系中，H5型特异性实时扩增图（H7和H9型特异性扩增图略）。结果证实，该方法特异性强，与其他检测对象无交叉反应。禽流感病毒一个亚型的病毒RNA作为模板，同时，加入针对H5、H7、H9亚型的引物、探针进行实时荧光RT-PCR检测，结果只得到相应亚型的特异性荧光曲线，证实所设计的引物探针具有型特异性。

2.3 三重实时荧光RT-PCR的干扰性试验

将H5、H7、H9亚型不同的模板浓度进行组合，发现当2个亚型模板浓度较高，而另一个亚型模板浓度较低，所建立的方法依然可以同时检测到各个亚型。三个亚型之间的其他浓度组合结果同上类似。

2.4 三重实时荧光RT-PCR对比试验

取89份经病毒鸡胚运用禽流感病毒H5、H7、H9亚型三重实时荧光RT-PCR进行盲检，进行分开检测的模式进一步产生样品的研究，得出的结论就是48份为禽流感病毒H9阳性，13份禽流感病毒H5阳性，2份为禽流感病毒H5和H9混合感染，26份为阴性。经过相关的比较，能够得到结论就是两者有着明显的相似程度，几乎没有差别。

2.5 三重实时荧光RT-PCR田间试验

采集的4 000多份喉腔棉拭子、泄殖腔棉拭子及临床采样的样品进行检测，阳性样品中，H9亚型的禽流感为12份，均为水禽样品；H5亚型的禽流感为5份，利用禽流感H5、H7、H9亚型三重实时荧光RT-PCR对临床结果检测到喉腔棉拭子阳性3份、泄殖腔棉拭子阳性12份、疑似病料4份。另有4份为H5和H9亚型的混合感染。检测的结果也是几乎没有任何差别，所以相关的方法需要进一步确立才能够投入使用。

3 讨论

3.1 单重与多重检测的比较

PCR技术作为一种高度灵敏、快速简便的方法现已经应用于很多病毒的检测，效率较高，是对传统检测模式的突破，已经广泛应用。但单重PCR在成本和检测时间上存在劣势，需要更加高端的技术出台，需要进一步降低成本。多重PCR用于病毒、细菌、真菌的高通量快速检测和其他方面的检测已经成为研究热点，用于多种微生物的检测及转基因的检测等。

3.2 建立组合

通过分别进行禽流感H5、H7、H9亚型单重实时荧光RT-PCR检测，确定所设计的引物和探针扩增效率高，有着比较高的灵活性，能够满足筛选的需要，可又进一步实现相关的内容整合。

3.3 三重实时荧光RT-PCR的干扰性

我们选取的各个病毒的模板量均为单重单检时效果较好的模板浓度，在建立多重实时荧光RT-PCR方法时，即3个亚型的模板浓度相对差别不大。但是如果有临床的干扰情况，那么就会出现一定的差距，进一步对现实产生了矛盾，将禽流感H5、H7、H9的模板浓度进行调整、组合，进一步讨论针对模版的浓度整合问题是否有着某种干扰。

4 小结

必须根据仪器的检测通道进行多重实时PCR检测时，来选择荧光标记基团，才能达到避免干扰、并且实现检测的效率性质提高。

[1] 朱文斯，赖平安，黄茜华，等.荧光RT-PCR快速检测禽流感病毒H5亚型的研究[J].中国医药导刊，2003，5（1）：27-30.

[2] 曹梅，田夫林，庄文忠.禽流感病毒血凝素分子生物学研究进展[J].动物医学进展，2004，25（2）：35-37，61 .

[3] 黄金海，王英珍，丁伯良，等.间接ELISA检测禽流感抗体方法的建立[J].动物医学进展，2004，25（4）：111-113.