电子束辐照技术对病毒活性的影响研究

张 汀，李 宗，陶 洁，廖金虎，朱国强，袁建设

（1.无锡检验检疫局，江苏 无锡 214101；2.扬州大学兽医学院畜禽病原微生物研究室，江苏 扬州 225009）

电子束辐照技术是借助电子加速器产生的电子束射线对食品和农产品中幼虫、卵和微生物体的强激发和电离辐射作用，使活体生物内部发生辐射化学和辐射生物学效应，致使有机体生殖力受损或使其生命合成物化学链中断，导致代谢功能紊乱，从而达到杀灭病毒、细菌和寄生虫等目的[1]。该技术不仅具有杀灭病毒、细菌和寄生虫作用，而且方便快捷，安全环保。

目前，电子束辐照主要应用于食品保鲜，在解决食品安全问题中具有独特的技术特色和优势，特别是在防止食品中食源性致病微生物污染和进出口检疫方面存在着巨大的应用潜力[2]。Luchsinger等[3]研究报道，利用电子束0～3.85 kGy辐照无骨猪肉，可以有效杀灭冷鲜肉中的大肠杆菌和沙门氏菌。电子束辐照效应的研究证明其对食品中的食源性微生物污染和致病菌都有着非常好的杀灭效果，是保障食品质量安全的有效技术手段，且在所用剂量范围内对食品品质和加工特性影响甚微[4]。但目前还没有利用电子束辐照技术杀灭病毒相关的研究报道。

本文重点论著电子束辐照技术对动物产品中有代表性病毒活性的影响研究，本研究采用无锡爱邦集团生产的电子10MeV直线电子加速器射线源，选用具有代表性的动物有囊膜病毒—新城疫病毒、牛疱疹病毒1型；无囊膜病毒—鸡传染性法氏囊病毒进行电子束辐照试验，初探其对动物病毒活性的影响。

1 试验材料

新城疫（Newcastle disease，ND）病毒；传染性法氏囊（infectious bursal disease，IBD）病毒和SPF鸡胚，从扬州威克有限公司购买；MDBK细胞和BHV-1病毒Coloradol毒株（采用美国进口材料，由美国宾夕法尼亚大学Dr.Bello惠赠，扬州大学兽医学院病原微生物实验组保存）。MDBK细胞采用DMEM（Gibco BRL）培养基和马血清（Hyclone）培养。DMEM基础培养基、马血清购自Hyclone公司；0.25%胰酶购自Gibco公司；25cm2细胞瓶、24孔细胞培养板、细胞冻存管购自Corning公司。

2 试验方法

2.1 鸡胚接种[11]

2.1.1 绒毛尿囊腔内接种 取9～11日龄SPF鸡胚，先在照蛋灯下检查鸡胚发育情况，划出气室位置，用锥子在酒精灯火焰烧灼消毒后，在气室交界处无血管处钻一小孔，用1 mL注射器从小孔处插入，深约针头的1/3长度，注射量为0.1 mL。注射后以石蜡封闭小孔，置孵育箱中直立孵育，逐日观察。

2.1.2 绒毛尿囊膜接种 取9～11日龄鸡胚，先在照蛋灯下检查鸡胚发育情况，划出气室位置，并选择绒尿膜发育区作一“记号”。将胚蛋横卧于蛋座上，绒尿膜发育区“记号”朝上。用碘酒消毒记号处及气室中心部，在气室中心锥小孔。然后用锥子轻锥记号处蛋壳，约0.5 mm深，使其卵壳穿孔而壳膜不破。用洗耳球吸去气室部空气的同时，随即因上面小孔进入空气而绒尿膜陷下形成一个人工气室，天然气室消失。接种时针头与卵壳成直角。自上面小孔直刺破卵膜进入人工气室约3～5 mm，注入0.1 mL病料，正好在绒尿膜上。接种完毕用熔化石蜡封闭两孔，人工气室向上，横卧于孵化箱中，逐日观察。

2.1.3 1%鸡红细胞制备 先用灭菌注射器吸取3.8%枸橼酸钠溶液（其量为所需血量的1/5），从鸡翅静脉抽血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000 r/min离心10 min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成1%悬液。

2.2 血球凝集试验（HA）[12]

在96孔“V”形微量反应板上进行，自左至右各孔加50 µL生理盐水；于左侧第1孔加50 µL病毒收获液，混合均匀后，吸50 µL至第2孔，混合均匀后，吸50 µL至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃50 µL，稀释后病毒稀释度为第1孔1:2，第2孔1:4，第3孔1:8……，最后1孔为对照；自左至右依次向各孔加1%鸡红细胞50 µL置微型混合器上振荡1 min或以后固定转圈振荡反应板，使血球和病毒充分混合，在37 ℃温箱中作用15～30 min后，待对照红细胞已沉淀可观察结果；判定结果：以100%凝集（血球成颗粒性伞状凝集沉于孔底）的病毒最大稀释孔为该病毒血凝价，即一个凝集单位，不凝集者红细胞沉于孔底呈点状。

2.3 细胞培养[13]

MDBK细胞用含10%马血清的DMEM培养基培养，在37 ℃于5% CO2培养箱中培养。培养液颜色改变时换液，或者每隔2～3 d换液。换液时，先将旧培养液倾斜至瓶底一角，用吸管吸出，然后加入PBS溶液洗涤培养物，吸出PBS溶液后再加入新的培养液。封口后继续培养。当细胞长成单层时，就将其分瓶传代，具体操作：先将旧培养液倾斜至瓶底一角，用吸管吸出，然后加入PBS溶液洗涤培养物，吸出PBS溶液后加入1 mL 0.25%胰酶，室温消化，待细胞大部分都变圆时，用吸管将胰酶吸出，然后加入新的培养基，用吸管将贴壁的细胞吹下来，再补加部分培养基，放培养箱继续培养。

2.4 病毒的分离培养

将长成单层的MDBK细胞消化，并铺于24孔细胞培养板中培养。待MDBK细胞融合度达80%左右时，弃去细胞培养液；并将BHV-1接种于单层MDBK细胞，吸附2 h；弃去细胞上清悬液，加入含2%马血清的DMEM维持液，在37 ℃于5% CO2培养箱中培养。接毒后72 h内观察细胞生长情况，培养96 h后，收获细胞培养物。将其在-20 ℃和室温冻融3次后，4 ℃，10000 g离心10 min；取上清，盲传3代后，收获细胞培养物。

2.5 NDV辐照方案

（1）NDV病毒用9～11日龄SPF鸡胚传代，该病毒应在96 h内致死鸡胚。测定半数致死量（ELD50）和血凝效价，收集尿囊液分装无菌青霉素小瓶中（玻璃瓶），-20 ℃保存。（2）准备2个不同病毒滴度的NDV样品（NDV弱毒苗原液，NDV弱毒苗10倍稀释液），每个样品各准备3份，采用无锡爱邦电子加速器公司的10MeV电子加速器进行静态辐照加工，设0、10、20、30 kGy 4个不同吸收剂量水平。（3）将辐照处理后的样品接种9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔，观察鸡胚有无死亡和病变，如果鸡胚没有死亡，则取鸡胚尿囊液，测定其血凝价并解剖观察鸡胚有无病变。

2.6 IBDV辐照方案

（1）选择9～11日龄SPF鸡胚，将IBDV病毒液接种于SPF鸡胚的绒毛尿囊膜。鸡胚通常在感染后4～6 d死亡。在鸡胚中连续3次传代以后，收集尿囊液，并测定其半数致死量，分装并存放于-20 ℃。（2）准备2个不同滴度的病毒样品（IBDV弱毒苗原液，IBDV弱毒苗10倍稀释液），每个滴度各准备3份，采用无锡爱邦电子加速器公司的10MeV电子加速器进行静态辐照加工，设0、10、20、30 kGy 4个不同吸收剂量水平。（3）将辐照处理后的样品接种9～11日龄SPF鸡胚，若鸡胚死亡，则说明该辐照方案无效；若鸡胚没有死亡，则收集鸡胚尿囊液，盲传3代后再判定结果。如果盲传3代后，鸡胚仍未发生死亡，则说明该辐照杀毒方案有效。

2.7 BHV-1辐照具体方案

（1）BHV-1在牛肾继代细胞（MDBK）上大量增殖扩毒，收集病毒悬液并测定其病毒滴度（PFU），分装并保存于-70 ℃。（2）准备病毒样品，共2份，每份各准备3个重复样品，采用无锡爱邦电子加速器公司的10MeV电子加速器进行静态辐照加工，设0、30 kGy 2个不同吸收剂量水平。（3）将辐照处理后的样品接种MDBK细胞，首先观察该病毒是否引起细胞病变；若没有细胞病变，则收集感染细胞悬液并盲传3代，观察细胞病变情况。

3 结果

3.1 NDV辐照试验结果

10 kGy辐照剂量处理的NDV样品尿囊腔接种鸡胚后，均有死亡情况，解剖胚体有出血等病变，尿囊液血凝价均高于28；而接种20 kGy和30 kGy辐照处理的NDV样品的鸡胚均未出现死亡情况，解剖胚体无病变，尿囊液无血凝价。说明30 kGy的辐照剂量就足以完全灭活NDV病毒。

3.2 IBDV 辐照试验结果

10 kGy和20 kGy辐照剂量处理的IBDV样品绒毛尿囊膜接种鸡胚后，均有死亡情况，解剖胚体有出血等病变；而接种30 kGy辐照处理的IBDV样品的鸡胚未出现死亡情况，解剖胚体无病变，盲传3代后仍无死亡情况。说明30 kGy的辐照剂量能完全灭活IBDV病毒。

3.3 BHV辐照试验结果

接种BHV 0 kGy处理样品的MDBK细胞在48 h内全部100%病变，而接种BHV 30 kGy处理样品的MDBK细胞在5 d后仍未出现细胞病变。将接种BHV 30 kGy处理样品的细胞收集起来，-40 ℃/室温反复冻融3次后，再次接种MDBK细胞，盲传3代，仍无细胞病变。说明该辐照试验有效，30 kGy的辐照剂量能够将牛（α）疱疹病毒BHV-1 Coloradol完全灭活。

4 讨论

本试验旨在通过不断的探索研究，摸索利用电子束辐照技术能够将病毒完全灭活的辐照剂量。

本试验中，我们选择了3种对外界环境耐受性较强的病毒，其中有2种是有囊膜病毒，即NDV和BHV-1，另一种是无囊膜病毒，即IBDV。我们选用了0 kGy、10 kG、20 kGy和30 kGy 4个不同辐照剂量来对ND、IBDV和BHV进行辐照试验，辐照试验数据表明，10 kGy的辐照剂量不能灭活NDV和IBDV，而20 kGy的辐照剂量能够将NDV完全灭活，但不能完全灭活IBDV。说明无囊膜病毒的耐受性要比有囊膜病毒的耐受性更强一些。而30 kGy的辐照剂量能够将NDV、IBDV和BHV-1完全灭活。

综上实验数据表明，电子束辐照技术可以很大程度的影响病毒活性，在一定辐照剂量下，能够有效杀灭致病病毒。对动物产品（含冷冻产品）相关病毒和食品中的食源性微生物污染和致病菌都有着非常好的杀灭效果，这在解决动物产品、食品安全中的致病性微生物问题中，具有独特的技术特色和优势，是保障动物产品、食品质量安全的有效技术手段，且在所用剂量范围内对货物品质和加工特性影响甚微，在创导绿色、环保、安全的质量控制要求下，电子束辐照技术应用于食品安全、疫病疫情的控制将是发展的方向，特别在国境口岸开展检验检疫处理工作方面，有着巨大的应用潜力和推广价值。

[1]Farkas J.Combination of irradiation with mild heat treatment[J].Food Control，1990，1（4）：223-229.

[2]陈其勋.中国食品辐照进展[M].北京：原子能出版社，1998.

[3]Luchsinger SE，Kropf DH，García Zepeda CM，et al.Color and Oxidative Rancidity of Gamma and Electron Beam-Irradiated Boneless Pork Chops [J].J Food Sci，1996，61（5）：1000-1006.

[4]李牧，邢增涛，冯志勇，等.电子束辐照在农产品贮藏保鲜中的应用[J].激光生物学报，2007，16（5）：640-645.

[5]Lindh E，Ek-Kommonen C，Vaananen VM，et al.Molecular epidemiology of outbreak-associated and wild-waterfowl-derived Newcastle disease virus strains in Finland，including a novel class I genotype[J].J Clin Microbiol，2012，50（11）：3664-3673.

[6]甘孟候.中国禽病学[M].北京：中国农业出版社，1997.

[7]Mahgoub H A.An overview of infectious bursal disease[J].Arch Virol，2012，157（11）：2047-2057.

[8]Saif Y M.禽病学[M].苏敬良，高福，索勋，等译.11版.北京：中国农业出版社，2005.

[9]李凯年.1型牛疱疹病毒（BHV-1）感染最新研究进展[J].畜牧兽医科技信息，2003，19（12）：12-14.

[10]Nandi S，Kumar M，Manohar M，et al.Bovine herpes virus infections in cattle[J].Anim Health Res Rev，2009，10（1）：85-98.

[11]陆承平.兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社，2007.

[12]焦新安.实验室手册[C].江苏扬州：江苏农学院传染病教研组，1993.

[13]薛庆善.体外培养的原理与技术[M].北京：科学出版社，2001.