褚 春杨 军王苏燕丁赛良邝 孛邓 彪江振涛
(1 南华大学附二医院药剂科,湖南 衡阳 421001;2 南华大学附一医院心内科,湖南 衡阳 421001)
血管成形术后再狭窄与平滑肌细胞转化和迁移及转化生长因子α表达上调有关
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(1 南华大学附二医院药剂科,湖南 衡阳 421001;2 南华大学附一医院心内科,湖南 衡阳 421001)
目的 为探讨血管成形术后再狭窄形成与平滑肌细胞(Smooth muscle cells,即SMCs)的迁移和表型转化,以及转化生长因子α(Transforming growth factor-α,即TGFα)在内膜增生过程中的表达变化的关系。方法 取40只Sprague-Dawle大鼠行右颈总动脉球囊内膜剥脱术建立再狭窄动物模型,于第1,3,9,28天和2月取实验动脉段和对侧正常动脉段行光镜观察及计算机图像分析,同时在透射电镜下观察SMCs亚微结构变化。并以放免测定内膜增生时损伤血管组织中TGFα表达的变化。结果 图像分析显示在球囊损伤第3天即见损伤血管中膜出现明显增厚,而后恢复正常厚度。与此同时球囊损伤第3天内膜明显增厚,而在第9~28天逐渐达到高峰;在透射电镜下观察可见:术后第3天损伤血管增生内膜中近腔面的SMCs就已主要表现为合成表型,在28d和2个月时大部分SMCs又恢复收缩表型的形态特征。而通过放免测定发现球囊损伤后第3天对血管组织TGFα表达明显增加,与对侧正常颈总动脉标本中的TGFα含量有统计学意义的差异。结论 故认为大鼠再狭窄模型的内膜增生过程具有明显的时相特征,SMCs从中膜向内膜的迁移,而SMCs的表型转化在这过程中显示出明显的双向转化特点,而TGFα在损伤血管的表达明显增加,可能参与了内膜过度增生过程的SMCs的表型转化和迁移的机制。
SMCs;转化生长因子α;再狭窄;血管内膜;损伤
经皮腔内冠状动脉成形术在冠心病治疗中已得到日益广泛的应用,但在临床上也面临着一个严峻的挑战——那就是术后再狭窄的发生,国内外学者对再狭窄预防进行了大量的实验研究及临床试验,但并未完全解决PCI术后再狭窄问题,为有效降低再狭窄发生率,人们对PCI术后再狭窄的发生机制进行了更深入的研究和探讨。
人们已经发现再狭窄发生是中膜SMCs表型转化后迁移到内膜不断增殖,不断分泌细胞基质的结果[1]。本实验拟通过大鼠再狭窄动物模型观察内膜增生时中膜SMCs表型转化及细胞亚微结构的变化,同时观察TGFα在内膜增生过程中表达的变化,为PTCA术后再狭窄发生机制的研究提供进一步的实验依据。
1.1 颈总动脉球囊损伤大鼠动物模型的制备
取Sprague-Dawle大鼠(体质量400~500g,雄性,由广州医学院实验动物中心提供)40只用戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后;在颈前作一正中切口,钝性分离左右颈总动脉,结扎远侧段,近端线拉阻断血流。在两线间靠剪一小口,缓慢逆行插入PTCA球囊导管,维持压力为3大气压,缓慢回拉导管平切口处,再减压至零。重复3次后退出导管。最后缝合切口,给予青霉素20万单位肌注以预防感染。术后1d、3d、9d、28d和2月处死动物。按照取材时间随机分成5个亚组,每个亚组各8只。
1.2 颈总动脉的病理切片检查
动物处死后取下双侧血管标本,左侧未损伤血管标本作实验内对照。标本固定后、切片后常规苏木精-伊红染色,光镜观察形态学变化。以内弹力膜与内膜面之间组织为新生内膜,以外弹力膜与内弹力膜之间组织为中膜,计算机图像分析系统测定中膜厚度、内膜面积、内膜面积增生比率=内膜面积/(内膜面积+中膜面积)×100%。
1.3 透射电镜观察
取大鼠损伤颈动脉和血管标本,大小约1mm3,4℃固定后经磷酸缓冲液浸洗后,用1%的四氧化锇后固定固定30min,冲洗后1%水质醋酸铀染色。PBS冲洗;12h后70%酒精梯度逐级脱水后,包埋、超薄切片,以醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色,用透射电镜观察。
1.4 TGFα含量的放免测定
取术后第3天处死的大鼠左右颈总动脉标本研磨制匀浆,按TGFα放免测定试剂盒说明书测定,在自动ā计数仪上测放射性,并得出样品TGFα浓度(pg/mL)。
1.5 统计学处理
实验中1只大鼠因手术意外而死亡,其余动物都在术后存活直至完成本实验。
2.1 光镜观察结果
对侧正常血管切片的内弹力膜完整,内膜由单层内皮细胞构成,无SMCs侵入。而球囊损伤后可见明显的内膜损伤及过度修复所致的内膜增生。术后第3天即可见内膜,中膜和外膜都有明显增厚,中膜可见大量梭形SMCs,排列紊乱。术后第9天时内膜进一步增厚,新生内膜中可见大量SMCs,纤维成分增多。28d时新生内膜进一步增厚,但内膜中SMCs数量明显减少,出现大量细胞间质堆积。2月后的血管标本的病理变化与术后第28天时相似,细胞间质替代SMCs成为增生内膜的主要成分。
2.2 病理图象分析结果
对侧正常颈动脉的中膜厚度、内膜面积、外膜下面积的各亚组之间比较无统计学差异(P>0.05)。实验中,球囊损伤内膜后3d,9d,28d和2月,新生内膜面积分别0.05±0.020,0.13±0.06,0.24±0.09,0.25±0.07和0.24±0.08μm2。同时外膜下面积和内膜加中膜面积也呈现出相应的时相变化。损伤后3d,9d,28d和2月的内膜/内膜加中膜面积分别为0.166±0.127,0.326±0.209,0.305±0.509和0.312± 0.484(与对侧正常颈动脉比较均为P<0.05)。在对血管中膜厚度的观察我们也发现:内膜损伤后不久,中膜即出现增厚,并在第3天有一个明显的高峰(与对侧正常血管相比分别为202.67±8.45和132.39±19.20,P<0.01),而到第9天时虽然内膜明显增生,但中膜厚度却已恢复到正常血管厚度。
2.3 透射电镜观察结果
由透射电镜可看到:从术后第3天,增生的内膜中近腔面的SMCs就已主要表现为合成表型:细胞异形,胞浆内细胞器增多,可见大量的线粒体、粗面内质网、溶酶体和高尔基体等,肌丝则明显减少,同时可见较多炎性细胞和巨噬细胞的浸润。到术后28d,在增生内膜中大部分的SMCs都恢复为梭形的收缩表型,胞浆内细胞器减少,但部分细胞的胞浆中仍可见溶酶体、线粒体等细胞器的增生,细胞间有大量的胶原纤维堆积,并可见巨噬细胞,增生内膜表面未见到有内皮细胞覆盖。
2.4 TGFα含量的放免测定
根据自动γ计数仪上放免测定的结果显示:在球囊损伤第3天后损伤动脉组织标本中的TGFα含量为(187.46±105.63)pg/g,而对侧正常颈动脉标本中测定的TGFα含量为(89.11±101.87)pg/g,两组比较其TGFα含量具有统计学意义的差异,P=0.0028<0.01。
血管成形术术后再狭窄发生机制主要与中层少数SMCs迁移到内膜不断增殖,不断分泌细胞基质有关,而SMCs的表型转化正是其此后迁移和增殖的启动环节。SMCs在局部环境的损伤信号调控下可发生去分化,由收缩表型转化成胚胎和新生儿期才出现的合成表型,形态和结构功能上都可发生了明显变化[1]。实验中通过透射电镜看到SMCs在内膜增生过程中存在这种表型变化特点,与Masakiyo N.的观察结果一致[2],而SMCs表型的这种双向转化的特点可能也是内膜增生具有一定的自限性、时限性的原因。而中膜厚度的时相性性变化可能与中膜表型转化SMCs向内膜的迁移有关。
SMCs的表型转化是其以后迁移和增殖的基础,而诱导SMCs表型转化和增生主要与局部的多肽生长因子有关[3],其中TGFα可能在其中起着重要作用。TGFα多存在于胚胎组织和肿瘤组织中,是组织分化发育和肿瘤形成过程中重要调控因子,也通常被认为是胚胎组织中EGF受体的主要配基。转化细胞表面的EGF受体常明显上调,并与TGFα一起形成促使转化细胞自主性生长的自分泌环[3],现人们已发现:表型转化后大量增殖SMCs具有胚胎期细胞的一些特点,而EGF受体数量也明显增加[4],同时有学者也发现高血压大鼠的血管SMCs中TGFα的表达明显升高[5],我们也发现:内膜损伤后,TGFα在损伤血管局部组织中的含量明显升高,较正常血管组织增加一倍以上。提示TGFα/EGFR信号通路对PCI术后再狭窄过程中的SMCs的表型转化和过度增殖可能起着重要的信号调节作用。
[1] Mugabe BE,Yaghini FA,Song CY,et al.Angiotensin II-induced migration of vascular smooth muscle cells is mediated by p38 mitogen-activated protein kinase-activated c-Src through spleen tyrosine kinase and epidermal growth factor receptor transactivation[J].J Pharmacol Exp Ther,2010,332(1):116-124.
[2] Masakiyo N.,Kimura T.,Ohishi H.,et al..Restenosis after pecutaneous transluminal coronary angioplasty: pathologic observations in 20 patients [J].J.Am.Coll Cardiol,1991,17(2):433-439.
[3] Inoue T,Node K. Molecular basis of restenosis and novel issues of drug-eluting stents [J].Circ J,2009,73(4):615-621.
[4] Freeman EJ,Sheakley ML,Clements RJ.Angiotensin II-dependent growth of vascular smooth muscle cells requires transactivation of the epidermal growth factor receptor via a cytosolic phospholipase A(2)-mediated release of arachidonic acid[J]. Arch Biochem Biophys,2010,498(1):50-56.
[5] 张放鸣,周建新,李渝萍.动脉粥样硬化血管平滑肌细胞中干细胞因子 mRNA的表达水平增加[J].高血压杂志 1999,7(4):363-365.
R541.4
B
1671-8194(2013)01-0073-02
湖南省科技厅重点课题项目(No.2009SK2010)和湖南省自然科学基金重点项目(No.11JJ2046)
*通讯作者: