抗鸭坦布苏病毒病卵黄抗体的制备及应用试验

胡紫霞，王汉清，王 立 ，殷冬冬，占松鹤 ，王楠楠，朱良强，王桂军

（1.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036；2.安徽省动物疫病预防与控制中心，安徽合肥 230031）

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck tembusu virus，DTMUV）引起的蛋鸭和种鸭一种急性传染病，病鸭以采食量和产蛋率急剧下降并伴有淘汰和死亡为特征[1-2]。该病自2010年首次在我国发现以来，目前在各蛋鸭场和种鸭场均有不同程度地发生，已成为危害养鸭业最严重的疾病之一。据调查，该病一旦发生流行，鸭群内发病率几乎为100%，产蛋率下降30%～60%，死淘率最高可达20%～30%，而且发病鸭群整体均匀度降低，抗病力下降，易继发感染其它细菌性疾病，给养鸭业造成严重的经济损失[3-6]。

鸭坦布苏病毒病发病急，传播迅速，目前尚无有效的疫苗可用，药物治疗效果也不理想，临床上较难控制[7]。本研究以鸭坦布苏病毒AH-F10株灭活免疫制剂多次免疫高产蛋鸡，制备抗坦布苏病毒高免卵黄抗体，经临床初步应用，对鸭坦布苏病毒病具有良好的预防和治疗作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料 鸭坦布苏病毒AH-F10株由安徽农业大学动物传染病实验室分离鉴定，保存于中国典型培养物保藏中心，编号CCTC V2012013；鸭坦布苏病毒琼扩检测抗原由本制备；SPF鸡胚由本实验室孵化器孵化10日龄用于实验；高产蛋鸡为合肥市某鸡场饲养的130日龄健康罗曼商品代蛋鸡，用于免疫接种鸭坦布苏病毒免疫制剂，制备高免卵黄抗体；3周龄樱桃谷商品代雏鸭购自安徽某种鸭场，且种鸭坦布苏病毒抗体阴性；琼脂糖、氯仿、硫酸铵等为国产分析纯。

1.2 鸭坦布苏病毒灭活免疫制剂的制备 取鸭坦布苏病毒AH-F10株接种10日龄SPF鸡胚增殖培养，收集接毒后84h左右死亡的鸡胚尿囊液，经甲醛灭活作为水相与白油及乳化剂按一定比例进行乳化，制成油包水型乳剂灭活免疫制剂。经无菌检验和安全检验合格后，4℃保存备用。

1.3 免疫高产蛋鸡 用上述制备的灭活免疫制剂免疫130日龄健康高产罗曼商品蛋鸡60只，首次经颈部皮下注射免疫，免疫剂量为0.8mL/只。分别间隔2周进行第2次和第3次免疫，免疫剂量为1.5mL /只，免疫途径相同。第3次免疫10d后进行第4次免疫，免疫剂量为2mL/只，于颈部和胸部皮下多点注射。

1.4 卵黄抗体制备 在第4次免疫后1周开始收获鸡蛋，测定卵黄中的鸭坦布苏病毒琼扩抗体效价。收集琼扩抗体效价达1∶32以上的鸡蛋作为高免蛋制备卵黄抗体。将高免蛋用自来水清洗污物后浸泡于0.05%百毒杀10min，然后用纱布擦干后晾干。用75% 酒精棉球进行蛋壳表面消毒，无菌操作打开蛋壳，分蛋清，将蛋黄倒入消毒玻璃烧杯内备用。将卵黄和灭菌生理盐水按1∶4的比例稀释，在高速组织捣碎机中2000 r / min 匀浆5 min，加青霉素、链霉素各1000 U / mL，然后按0.01%加入硫柳汞，分装于灭菌玻璃瓶中，加塞密封并标记，置室温立即进行纯化或置于-20℃冰箱备用[8-9]。

1.5 卵黄抗体纯化 取上述粗制卵黄抗体，加入1倍体积的氯仿，充分振荡后，4000r/min.离心20min.，收集上层水相，加入饱和硫酸铵使其终浓度为50%，4℃静置1 h，5000r/min.离心20min.，弃上清，用与原卵黄抗体等体积的灭菌生理盐水溶解沉淀，加入饱和硫酸铵，使其终浓度为30%，5000r/min.离心20min.，弃上清，用与原卵黄抗体体积相等的0.01mol/L的PBS（pH7.4）溶解沉淀，透析24h，在-20℃冰箱中保存备用[10]。

1.6 纯化卵黄抗体的无菌检验、效价测定和安全检验 在无菌条件下，分别取0.2mL上述纯化的卵黄抗体接种鲜血琼脂平板和厌氧肉汤平板中，37℃培养48h，观察细菌生长情况；采用琼脂扩散方法检测纯化卵黄抗体的琼扩效价；安全检验，取健康雏鸭16只随机分为2组，一组为试验组，腿部肌注纯化的卵黄抗体1mL/只，另一组为对照组，腿部肌注生理盐水1mL/只，连续观察雏鸭状况72h，72h后剖检雏鸭，观察心、肝、脾、脑等器官有无病理变化。

1.7 卵黄抗体对雏鸭的保护力检验 将3周龄健康雏鸭30只，适应性饲养1周后随机分成A、B和C 3个组，每组10只。A组鸭腿部肌注纯化卵黄抗体0.5mL/只，B、C组作对照。24h后，将A和B组鸭分别经腿部肌注AH-F10毒株0.5mL/只，C组鸭经腿部肌注灭菌生理盐水0.5mL/只。将3组雏鸭隔离饲养，连续观察1周，观察雏鸭发病和死亡情况。

1.8 卵黄抗体对成年鸭的治疗试验 从某养鸭户购买186日龄健康产蛋麻鸭20只，人工感染AHF10毒株0.5mL/只，观察感染鸭采食、饮水、产蛋和精神状态，待出现精神不振、采食减少时，肌注上述纯化卵黄抗体2mL/只，每日1次，连续注射3天。连续2周，观察试验鸭的采食和产蛋量恢复状况。

2 结果

2.1 卵黄抗体检测结果 无菌条件下，纯化卵黄抗体在鲜血琼脂平板和厌氧肉汤平板37℃培养48h后，均无细菌生长，菌检均为阴性。采用琼脂扩散方法检测纯化卵黄抗体的琼扩效价达1∶32以上，纯化卵黄抗体与抗原之间出现清晰致密的沉淀带。安全检验结果为：试验组和对照组雏鸭均未呈现异常症状，72h后对16只雏鸭进行解剖，结果表明与对照组相比，试验组雏鸭心、肝、脾、脑均未呈现任何病理变化，说明制备的卵黄抗体安全性良好。

2.2 卵黄抗体对雏鸭的保护力检验 注射抗体后进行AH-F10攻毒的A组有1只雏鸭在攻毒第2天出现减食和腹泻症状，第5天恢复正常，观察期内未见死亡。观察1周后捕杀，均无肉眼可见病变。没有注射纯化卵黄抗体的B组雏鸭，经AH-F10毒株攻毒第3天均出现精神沉郁，减食，腹泻、拉绿色稀粪，喜卧，并伴有轻度神经性症状。观察期内死亡8只，解剖见脑膜、肝脏、胰腺出血，肠道肿大。对照组C组雏鸭一直保持良好精神状态，试验期间均未见发病、死亡，1周后后捕杀均无肉眼可见病变。表明制备的卵黄抗体对抗雏鸭坦布苏病毒病有良好的保护效果。

2.3 卵黄抗体对成年鸭坦布苏病毒的治疗效果 试验鸭从鸭场购买回来隔离饲养，人工感染鸭坦布苏病毒病后3天，部分试验鸭出现精神沉郁、采食量减少，所有鸭停止产蛋。应用本实验室的制备纯化的抗鸭坦布苏病毒抗体紧急治疗，注射后第2天采食量略有回升，精神状态略有好转。治疗第4天，1周后鸭群的采食基本恢复正常，部分鸭开始产蛋。结果表明，应用该卵黄抗体能有效控制产蛋鸭坦布苏病毒病，对感染产蛋鸭的采食量和产蛋率的恢复有良好的治疗效果。

3 小结和讨论

3.1 卵黄抗体因其具有性质稳定、成本低、产量高的优点，已广泛用于生物及医学领域，在家禽、家畜及人类疾病诊断与防治方面应用广泛，对病毒性疾病治疗更是具有独特优势[11]。利用异源动物制备高免卵黄抗体，具有动物种系发生距离优势，更适于产生特异性抗体，具有良好开发前景。应用卵黄抗体治疗动物传染病方面研究已有不少报道[12，13]，尤其在预防和治疗一些家禽急性传染病如鸭病毒性肝炎、鸡传染性法氏囊病等发挥重要的作用[11，14]。

3.2 鸭坦布苏病毒病是近年来在我国出现的鸭急性传染病，目前自然发生该病主要引起种鸭和蛋鸭的产蛋下降。鸭坦布苏病毒AH-F10株是本实验室从安徽发病鸭场分离到的，经人工攻毒试验发现其对雏鸭也有较强的致病性，并引起雏鸭死亡。因此，本研究用雏鸭人工攻毒试验来观察卵黄抗体对鸭坦布苏病毒病的预防和治疗作用。在当前尚没有有效的疫苗预防的情况下，采用卵黄抗体预防和控制鸭坦布苏病毒有着积极意义。

3.3 对正处于高产的种鸭和蛋鸭一旦暴发鸭坦布苏病毒病，产蛋率在短时间内急剧下降，在没有继发感染情况下，一般2～4周流行自行结束，采食量和产蛋率逐步恢复。由于没有特效药物治疗，不少养鸭场在发病期间使用利巴韦林、黄芪多糖、金刚烷胺等抗病毒药物来治疗鸭坦布苏病毒病。从治疗效果来看并不理想，而且发病期间使用抗病毒药物的鸭场在流行结束后产蛋率的恢复更为缓慢，因而，应用高免卵黄抗体对特异性地预防和治疗鸭坦布苏病毒病，对鸭群产蛋率的恢复有较好的促进作用。

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