结核分枝杆菌药物敏感性表型检测的研究进展

2013-01-22 07:16申晓娜赵雁林肖和平
中国防痨杂志 2013年6期
关键词:异烟肼利福平敏感度

申晓娜 赵雁林 肖和平

结核分枝杆菌(Mtb)药物敏感性(简称“药敏”)检测是耐药结核病诊断和治疗的关键,主要有表型检测法和基因型检测法两大类。尽管近年来分子生物学技术飞速发展,新的实验诊断技术不断出现,但常规细菌学表型检测由于其客观性、直观性等优点,仍是目前重要的实验诊断手段。为了在结核病防治过程中更好地运用这项技术,笔者现就Mtb药敏表型检测方法及其研究进展情况综述如下。

一、直接培养观察的方法

(一)传统培养法

Mtb药敏试验传统培养法包括绝对浓度法、比例法和抗性比率法,该种方法具有生长依赖性,在得到分离菌株后需要3~4周才能获得药敏试验结果,阴性结果报告时间需延长至8周。目前多采用绝对浓度法或比例法,绝对浓度法是我国各级实验室多年来普遍沿用的方法,操作简单,但对于细菌悬液的麦氏浓度的制备及菌液接种量的要求非常严格,不同操作者存在很大的个体差异。比例法是WHO推荐的标准药敏试验方法[1],该法采用了两种菌液浓度(10-2g/L和10-4g/L)对菌液接种量进行了校正,最终计算的耐药百分比更为精确。有文献报道这两种方法有较高的符合率,异烟肼、链霉素、利福平、乙胺丁醇两种方法测试结果的一致率分别为96.2%、97.1%、98.7%、96.9%[2],两者耐药率的差别主要与选定的药物临界浓度有关[3];为了能更好地与国际接轨,便于信息交流,建议有条件的实验室可以开展比例法药敏试验[4]。

(二)显微镜观察法(MODS)

显微镜观察药敏检测方法(microscopic observation drug susceptibility assay,MODS)是2000年Caviedes等[5]建立的用显微镜观察液体培养基中Mtb的形态学进行耐药性检测的方法,可通过倒置显微镜观察是否有Mtb索状结构来确定是否有Mtb生长,观察含药孔Mtb生长与否判断耐药性。文献报道MODS与传统罗氏药敏结果相比有较高的敏感度和特异度,异烟肼、利福平及耐多药(MDR)结核病的测定敏感度分别为88%、96%、91%;特异度分别为89%、90%、90%[6];与 BACTECTMMGITTM960比较,异烟肼、利福平及 MDR测定符合率分别为92.9%、95.5%、97.3%[7],链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星、阿米卡星和卷曲霉素结果符合率分别为90.21%、88.09%、93.62%、87.23%、92.34%、88.51%和86.81%;检测敏感度分别为83.33%、85.11%、90.74%、85.71%、86.73%、76.92% 和77.08%;特 异 度 分 别 为 96.06%、92.55%、96.06%、88.19%、96.35%、91.80% 和 89.30%[8]。平均7d左 右报告结果,操作简便且价廉,无需昂贵仪器设备,适合发展中国家和经济欠发达地区,应用前景广阔。

(三)E-test法

E-test的药敏试纸条为AB BIODISK公司的专利产品,试纸条上药物含量从低到高覆盖了15个连续倍比稀释浓度,是根据琼脂扩散法原理设计的,将不同浓度的试纸贴于种有生长不同细菌的培养基表面,药物扩散形成浓度梯度,作用细菌后产生抑菌环,根据抑菌环位置所指试纸上的刻度可确定该药对该菌的最低抑菌浓度(MIC)。如将试纸置于含有Mtb的琼脂培养基上,根据测得MIC即可判断Mtb耐药情况。该方法5~10d出结果,该方法为定量检测,结果准确,快速;操作简便,不需特殊仪器设备;可用于联合药敏试验;易于标准化操作和质量控制,但有报道显示,与罗氏金标准比假阳性率高,符合率低,仅为48.6%[9],且 E-test试纸条价格昂贵,难以推广使用。

二、快速培养仪检测系统

(一)BACTECTM460TB系统

BACTECTM460TB系统原理是通过在培养基加入14C标记的底物,检测代谢中释放的14CO2量以判断生长情况而得知其耐药性,该方法较罗氏培养法,初分离时间大大缩短,分离阳性率有所提高;耐药性检测与绝对浓度法和比例法符合率达95%~100%[10],结果可靠,检测时间明显缩短。对几种一线抗结核药物在获得Mtb培养物后,再需4~8d即可得到药敏试验结果。由于对环境的放射性污染,目前已逐步被更加完善的BACTECTMMGITTM960系统替代。

(二)BACTECTM MGITTM960系统

BACTECTMMGITTM960系统是通过氧熄灭荧光感受器检测分枝杆菌的有无。MGIT管底部包埋的O2敏感荧光显示剂,正常情况下激发的荧光能被溶解于培养基中的O2所淬灭,当培养管中有Mtb生长时O2被消耗,荧光探测器自动探测荧光显示剂激发的荧光强度,可通过含药的MGIT管荧光强度判定Mtb是否耐药。有文献报道全自动MGITTM960系统培养方法的敏感度和特异度高于罗氏培养法,报告时间平均缩短至6~9d[11-12],是目前最为理想的快速 Mtb培养、鉴定和药敏试验检测系统,已在我国各大临床检验及实验室广泛应用。

(三)BACTECTM9000MB系统

BACTECTM9000MB系统是采用液/固双相系统,利用氧特异性的感应器以荧光显示耗氧量来监测分枝杆菌生长过程中O2浓度的变化来判断其生长情况。与BACTECTM460TB系统相比,以荧光显示耗氧量替代了放射线,其临床标本的 Mtb分离率和BACTECTM460TB系统相当[13],与BACTECTMMGITTM960系统相比,检出率差异无统计学意义,污染率低,但时间较长,平均13.2d出结果,检测时间虽长于BACTECTM460TB系统及BACTECTMMGITTM960系统,检出率及培养时间明显优于传统罗氏培养法[14]。

(四)BacT ALERT 3D系统

BacT ALERT 3D系统利用颜色感应器来监测分枝杆菌生长过程中释放的CO2,随着CO2浓度的升高,感应器的颜色会发生变化,可根据颜色变化的不同来判断其生长状况。待检的培养瓶内有微生物生长时,代谢过程中所产生的CO2可经过BacT/ALERT培养和检测系统半透膜渗透至瓶底,与固定于瓶底的Novel/CO2感应器结合,伴随CO2浓度的增加,pH值发生变化,颜色由绿色变为黄色,产生CO2量的多少与分枝杆菌生长程度呈正相关,当出现阳性培养瓶时,通过光电检测得知CO2变化情况并经计算机处理后,系统用报警或屏幕显示等方式提示,在曲线图上反映、分析、判断阴性或阳性结果,该系统可在任何时间内放入培养瓶,通过条码识别允许该标本进入系统,并连续跟踪监测。该系统可检测血液和其他样本的分枝杆菌,但无法确定是哪一种分枝杆菌,因此提示阳性报告的培养物要做进一步的菌种鉴定;还可测试分枝杆菌对吡嗪酰胺、利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇等的敏感度,有文献报道,与罗氏培养法比较,氨基糖苷类、利福平、乙硫异烟胺、环丙沙星药物敏感度检测的符合率为100%,异烟肼为91.5%,吡嗪酰胺为85%,乙胺丁醇为72.4%,药敏试验种类对分枝杆菌检测时间约为10d[15],明显快于金标准罗氏培养法。该系统是目前我国应用各类快速微生物培养系统中使用最多的一种,但试剂的价格昂贵也是限制其推广应用为常规检测的主要因素。

(五)Dio-TK快速自动比色培养系统

Dio-TK快速自动比色培养系统是一套显示分枝杆菌和杂菌生长的图像系统,它能够通过连续的比色分析将真实的分枝杆菌生长与污染区别开来。将标本接种于含有多种颜色指示剂的培养基上,当Mtb的生长或其他菌存在时培养基发生不同颜色的变化,系统自动连续比色分析,提供描述性生长曲线,判断其有无分枝杆菌生长,同时还可以区别杂菌污染。分离率不及罗氏培养法及BACTECTM460TB系统,药敏结果与比例法和BACTECTM460TB系统有较好的一致性,报告时间为15d左右[16]。该系统对操作技术要求高,Dio-TK培养基对酸碱度(pH值)敏感,如果NaOH处理过的样本没有很好地中和,通过从红色变为黄色的颜色变化来检测Mtb的生长就需要更长时间,且易污染,使之难以推广使用。

三、氧化还原指示剂法

(一)Alamar blue法

Alamar blue法是通过氧化还原指示剂Alamar blue的颜色变化反应Mtb在培养基中的氧化还原反应,从而判断其生长情况。Alamar blue为一种基于氧化还原反应的指示剂,该指示剂带有荧光标记,还原后的Alamar blue可利用酶标仪进行荧光定量检测,应用最多的是利用其进行化合物的活性检测,以及评估原核和真核的细胞毒性[17-18]。1995年Yajko等[19]首次把Alamar blue应用于微量最低抑菌浓度(MIC)检测中,建立了 Alamar blue微孔板稀释法(MABA)。当Mtb生长时,指示剂可发生还原反应,由其氧化状态的蓝色转变为还原状态的粉色,阻止这种颜色变化的最低药物浓度为MIC。Farnia等[20]在此方法的基础上进行了简化,只利用一个临界浓度来检测临床菌株的耐药情况。以罗氏比例法为金标准,利福平的敏感度和特异度均为100.0%时,异烟肼的敏感度和特异度分别为96.6%和100.0%[21]。该方法获得结果仅需要7~10d时间,可以快速获得定量的MIC药敏结果,但其试剂较昂贵,难以广泛应用。

(二)刃天青法

刃天青与Alamar blue具有相似的结构成分,作用原理类似,2002年Palomino等[22]把刃天青应用于到Mtb药敏检测领域,建立了刃天青微孔板稀释法(REMA)。本法实验结果可以在接种7d内获得;Martin等[23]采用本法对乙硫异烟胺、卡那霉素、卷曲霉素、氧氟沙星和对氨基水杨酸5种药物的耐药性进行了检测,特异度均为100.0%,敏感度从96.8%到100.0%之间,其中氟喹诺酮类敏感度和特异度均达到了100.0%;与传统罗氏培养基的绝对浓度法比,利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素药敏试验的敏感度分别为92.3%、90.6%、92.9%、87.5%,特 异 度 分 别 为 96.0%、90.6%、94.0%、87.5%,准 确 度 分 别 为 93.8%、90.6%、93.8%、87.5%[24],实验结果均较为理想。该指示剂价格低廉,实验结果容易判读,可获得定量结果,可推广使用。

(三)噻唑蓝(MTT)法

MTT可在活细胞存在下经氧化还原反应生成蓝色的结晶,该方法是通过分光光度计检测蓝色结晶来反映活细胞数目。MTT是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下生成蓝色的结晶,死细胞不具有还原MTT的功能,结晶的生成量仅与活细胞数目成正比,溶解该结晶后,可以利用分光光度计检测490nm处的光密度(A)值,以反映出活细胞数目。1998年 Mshana[25]将MTT用于Mtb微量 MIC快速检测利福平的耐药性中,建立了MTT微孔板稀释法(TEMA)。Pontino等[26]和Ferrari等[27]采用 MTT法检测一线抗结核药物的耐药性,以比例法和BACTECTMMGITTM960法测定结果为考核标准,结果显示MTT法检测链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇的药敏结果符合率均在95%以上。Morcillo等[28]将其用于二线及一些选择性抗结核药物的耐药性检测中,结果显示,与比例法相比,除了卷曲霉素敏感度为90.9%之外,左氧氟沙星、阿米卡星、对氨基水杨酸、克拉霉素、环丝氨酸、氯法齐明、利福布丁的敏感度均在96%以上,特异度均在98%~100%之间。该方法结果在8d获得,MTT价格低廉,易于推广。

四、酶活性测试法

(一)硝酸盐还原法(NRA)

NRA的原理是通过测试硝酸还原酶来判定细菌生长情况。NRA法是将培养基内加入硝酸盐,利用Mtb代谢过程中产生硝酸还原酶能使硝酸盐还原为亚硝酸盐,并与显色剂发生显色反应的特性来判定细菌生长情况,硝酸还原酶含量的不同显色剂可从粉红色变为紫红色到深紫红色。有文献报道,与BACTECTMMGITTM960比较,异烟肼、利福平敏感度分 别 为 100.0% 和 95.6%,特 异 度 分 别 为 97.0% 和100.0%,比较显示异烟肼和利福平的检测一致性较好[29],对链霉素和乙胺丁醇的一致性较低[30]。有极少Mtb菌株为硝酸还原酶阴性,不适合使用该方法。NRA法平均10d报告结果,操作简便,快速,不需特殊仪器设备,费用低廉,应用前景较好。

(二)烟酸测定法

快速烟酸测定法是通过测定Mtb代谢产物烟酸来测定Mtb是否生长。2,4-二硝基氯苯等物质能与烟酸发生颜色反应,当有Mtb生长时,产生的烟酸即可在管内发生肉眼或仪器可检测到的颜色变化。与改良罗氏培养法比平均提前10d左右[31],试剂也便宜得多,并且能在各级医院推广。但快速烟酸测定法比较局限,只有Mtb才产生烟酸,仅限于检测Mtb。近年来缺乏相关研究。

(三)Wayne法

Wayne法是基于检测烟酰胺酶/吡嗪酰胺酶(PZase)活性来反映吡嗪酰胺的耐药性的。PZase可将吡嗪酰胺转化为有杀菌作用的吡嗪酰胺酸,将培养基中加入硫酸亚铁氨,它能与吡嗪酰胺酸反应产生颜色变化,通过颜色变化反应PZase活性[32],PZase失活则造成吡嗪酰胺耐药,该法7d可能得到结果,但仅局限于反映吡嗪酰胺一种药的耐药性,较少应用。

五、生物发光技术

(一)荧光素酶信号噬菌体法(LRP)

LRP法是利用荧光素酶在三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)存在条件下可以分解的特性,同时在外加底物荧光素的作用下,可产生一定量的光子,通过光敏检测器检测光子的产量可反映ATP的含量,从而反映活菌情况。ATP是细菌能量代谢的指标,生物半衰期短,当细菌生长抑制或死亡后,胞内ATP含量即明显下降或消失,因而可作为活菌的标志,用荧光素酶基因重组的噬菌体去感染Mtb,含有荧光素酶编码基因的分枝杆菌噬菌体在Mtb体内繁殖,并产生荧光素酶作用于荧光素,产生生物发光,通过检测荧光信号的强弱来反映细菌生长情况。据文献报道,该法与传统罗氏培养法相比符合率为87%,敏感度和特异度分别为90%和81%[33]。该法可以直接用于痰标本的药敏检测,无需分离菌株,72h内可检测出结果,简便、准确、快速,并可自动化测量,但是培养基易污染,易因杂菌存在造成假阳性,仍有待改进,尚不能普及。

(二)ATP生物发光法

ATP生物发光法是通过将Mtb直接裂解并提取细胞内的ATP,通过加入生物发光试剂,并利用光度计检测发光量测定ATP含量,通过测定含药培养基中培养的Mtb的ATP含量的不同得到其药敏结果。该法报告时间是3d,与比例法一致性高,重复性好,简便,但是操作繁琐,影响因素较多[34],且ATP存在于所有细胞中,故该法特异度较差。

六、噬菌体生物扩增法(PhaB)

PhaB法是利用分枝杆菌噬菌体D29感染活的分枝杆菌,用硫酸亚铁胺杀灭Mtb外的噬菌体,D29在菌体内大量扩增导致细菌溶解产生蚀斑,通过计数蚀斑数目来衡量Mtb在无药和含药培养基中活菌数量,从而判断其耐药性。裂解型分枝杆菌噬菌体D29由Froman等1954年首次分离成功,可感染快生长的耻垢分枝杆菌和慢生长的Mtb[35]。D29在耻垢分枝杆菌中发生溶菌循环的一个周期为90min,快于对Mtb的溶菌时间(13h)。该方法的基本操作是将待检培养物或涂片抗酸杆菌阳性痰标本与抗结核药物作用24~48h后,加入分枝杆菌噬菌体D29,37℃孵育1h,加入杀病毒剂,室温作用5min,再加入指示细胞(通常采用耻垢分枝杆菌),混合在固体琼脂平板上,37℃孵育24~72h,并设未加药对照管。计数每块平板上的嗜菌斑数目,计算每个菌株的加药管与对照管的嗜菌斑减少百分比。加药管与对照管的嗜菌斑减少百分比超过95%或99%判为敏感,反之为耐药。该方法与罗氏培养法比较,利福平耐药性检测有较高的敏感度和特异度,分别为100%、98%;异烟肼敏感度、特异度稍低,分别为80.4%、80.8%[36],以 BACTECTMMGITTM960测定结果为判断标准,阿米卡星耐药性检测中PhaB法的敏感度、特异度及符合率分别为89.3%、98.8%、96.3%[37],有学者利用此法用于氟喹诺酮类药物的药敏实验时,由于不能识别敏感株,建议在选择该法行耐药性检测时需谨慎[38]。该方法48h内可回报结果,快速、安全、简单、直观,无须特殊的设备,成本低廉,但对操作技术要求严格,易于向发展中国家推广。

七、流式细胞仪技术(FCM)

FCM法是通过向Mtb含药培养基中加入乙酰乙酸荧光素(FDA)指示剂,活的分枝杆菌能迅速水解外来的FDA为游离的荧光素发出荧光,通过流式细胞仪检测带荧光的分枝杆菌,检测Mtb的活菌量,从而判断耐药性。FDA是一种非极性非荧光物质,能够渗入分枝杆菌胞体内,活的分枝杆菌能迅速水解外来的FDA为游离的荧光素而发出荧光,而被抑制或死亡的菌体由于胞体内酯酶大量减少,荧光素生成亦少,再利用流式细胞仪检测荧光素的含量,从而计算活菌的数量,测定菌株的耐药情况。考虑到安全因素,Moore等[39]对本方法进行了改良,在用FCM检测前用特殊的化学物质对Mtb进行灭活,在保持检测高敏感度的前提下,改善了检测的安全性,且在72h内可得出结果。FCM法检测分枝杆菌的准确度和敏感度均较好,但耐药和敏感的判断并没有明确公认的标准,且影响因素较多,如细胞聚集、菌体大小、杂菌等,特异度较差,同时流式细胞仪价格昂贵,技术要求较高,难以推广。

上述各种Mtb表型药敏检测方法在Mtb耐药性检测中发挥着重要作用,尽管近年来涌现了很多新的Mtb基因型快速药敏检测方法,但在将来几十年中表型药敏检测方法作为重要的实验诊断手段仍将沿用。Mtb表型药敏检测不断发展,新出现的各种方法也在不断完善,但仍存在不足,还需要现有的方法进行大量的对比研究,以建立经济、简便、快速、灵敏的耐药性检测方法,并加以推广应用,满足结核病临床发展的需要,指导临床合理制定用药方案,控制耐药结核病的扩散。

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