“成血管化”对组织工程骨成骨的影响

冯 琳 刘洪臣

在临床工作中，骨移植术一直用于修复由创伤、肿瘤、感染所造成的大范围骨缺损的传统方法，并成为修复骨缺损的“金标准”。如何提高成骨质量，成骨速度成为当前组织工程骨研究的热点与难点。

目前修复骨缺损的方法有以下几种：自体骨的移植；异体骨的移植；人工替代物替代；组织工程骨的植入。前3 种方法已在临床中已使用多年，虽然经不断改进，但仍存在不少缺点。随着组织工程技术的不断发展，组织工程骨有望成为修复大段骨缺损的理想方法，因此也成了目前治疗骨缺损研究的热点。[1-3]

关于组织工程骨的研究己证明，用组织工程化骨修复小的骨缺损时，其早期的成骨程度及后期的骨愈合效果均非常良好。但是，应用大块的组织工程化骨修复大段的骨缺损时，其中心的部份经常因缺血而发生坏死。同时，天然骨的存活和生长主要是由于其自身周围及内部丰富的血液供应，可以为其提供各种营养物质、活性生长因子及氧等，同时也可以及时排出其内部及周围的各种代谢废物。通过这种现象也可以说明，在实施骨组织工程技术修复骨缺损，尤其是大面积骨缺损的过程中，在新生的骨组织形成之前构建血供系统是极其重要的一步。因此，骨组织移植物的血管化成为组织工程骨修复骨缺损的关键环节之一，其已被认为是骨组织工程继种子细胞、支架材料、细胞因子三大要素之后的又一重要因索[4，5]。

本文就血管生成基本过程，有关细胞，因子等以及促进组织工程骨成血管化的方法分别予以叙述。

1. 血管生成基本过程

血管生成是一个包括细胞、生长因子、细胞外基质、生物力学刺激等多因素相互作用的复杂过程，其基本过程包括：

1.1 血管新生启动阶段 在缺氧时或某些细胞因子作用下，以血管通透性增加为特征。

1.2 进展阶段 蛋白水解酶降解细胞外基质，脱离并穿过血管壁进入细胞外基质，形成结节状或锥体状血管芽。

1.3 形成阶段 单个血管芽生长变形形成血管腔，并与邻近血管芽相互吻合成血管网。

1.4 塑形和改建阶段 血管平滑肌或其他细胞迁移包绕新生血管，产生细胞外基质，进而形成完整的血管壁结构，待创伤愈合后，部分新生血管将蜕化[6]。

2. 构建组织工程骨血管化的有关细胞

2.1 血管内皮祖细胞 EC(Endothelial Cell 血管内皮细胞)是血管壁内层的基本结构，是保证血管正常结构、维持通透性的必要成分，内皮损伤会形成血栓，甚至导致血管完全堵塞。因此，构建组织工程化血管必须首先选择合适的内皮细胞Kofron[7]等将几种内皮祖细胞与胶原凝胶体外联合培养， 发现循环血中的 EPC (Endothelial Progenitor Cell 血管内皮祖细胞)生成毛细血管网能力最强。进一步EPC 研究表明，为了发挥EPC的复制潜力，可以借助聚合酶，经人类逆转录酶转染的方法异位表达内皮细胞，以延长成体细胞的寿命，形成缺血区的动脉血管网。

2.2 平滑肌细胞 直径为0.2mm 以上的血管尤其是动脉血管均有平滑肌结构，它是维持血管弹性和功能的成分，属于血管的中层结构。组织工程技术己试图将SMC (Smooth Muscle Cell 平滑肌细胞)与EC 复合培养构建小血管。Cho[8]等分化出SMC，与EC 复合培养并修补狗下腔静脉壁。3 周后，经大体观察、组织学切片和荧光标一记检查，证实细胞均成活良好，血管壁光滑无血栓形成，内壁有完整的内皮细胞生长覆盖。目前，SMC 主要来源于骨髓或脂肪，也可取自较大静脉血管壁和脐动脉血管壁。

3. 促组织工程骨血管化的有关因子

生长因子是血管形成中最核心和最复杂因素。通过基因缺陷和受体突变模型等方法己分离出38种促血管因子和46 种血管形成抑制因子。促血管生成因子主要为血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管生成素、血小板衍化生长因子、转化生长因子、肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子等。

3.1 血管内皮细胞生长因子 VEGF (Vascular Endothelial Grow th Factor，血管内皮细胞生长因子)为糖蛋白家族，包括6 大成员，分别为血管内皮细胞生长因子- A、B、C、D、E 和胎盘生长因子。为血管生成初期最重要的促进因子，具高度保守性，是血管内皮细胞高度特异性的生长因子。Liu 等[9]发现梯度VEGF 可以刺激体外培养的内皮细胞定向移动，利于生物材料内部血管形成。

3.2 成纤维细胞生长因子 成纤维细胞生长因子FGF 家族和血管内皮细胞生长因子均是经过临床证实具有促血管生成活性的细胞因子。Jansen等[10]将复合FGF- 2 的胶原支架种植于大鼠粘膜骨膜下，发现1 周和2 周时细胞密度及新生血管数量均有明显增加。它既是成纤维细胞有丝分裂原，也是内皮细胞趋化因子，可有效促进血管生成。其作用可能是间接通过血管内皮细胞生长因子及受体而起作用。

3.3 转化生长因子- β 转化生长因子- β(TGF- β)在体外抑制内皮细胞增殖，但对体内血管形成作用有促进作用，可能是通过招募巨噬细胞和成纤维细胞并分泌血管生成相关因子而发挥稳定血管壁作用。Zhu 等[11]将内皮前体细胞与转染TGF- β 的平滑肌细胞(实验组)共培养21 天，发现实验组平滑肌高表达VEGF，内皮细胞集落明显增多，内皮前体细胞和平滑肌细胞间的粘合力比对照组明显增高，证明TGF- β 转染的平滑肌细胞有助于内皮细胞粘着和分化有利于血管生成。

3.4 血管生成素 ANG(Angiopoietin，血管生成素)，包括血管生成素l,2,3,4(Ang1,2,3,4),与血管生成素关系密切的是Ang- 1 和Ang- 2，均与Tie- 2 受体结合。Ang- 1 特异性作用于血管内皮细胞表面的，在肌肉、子宫等血管丰富组织内广泛表达，特异性作用于血管内皮细胞表面的Tie- 2受体，促进受体自身磷酸化；表达活化Tie- 2 的内皮细胞，吸引血管平滑肌细胞，周细胞等血管周围细胞包围支持内皮细胞，形成完整血管壁，促进血管重塑、成熟；在成熟血管中，Ang- 1 还增加内皮细胞和周细胞间连接，维持内皮细胞静息状态的血管完整性，抑制内皮细胞调亡，促进血管损伤后再内皮化。Ang- 2 是Ang- 1 的拮抗剂，在内皮细胞竞争、抑制Ang- l 引起的Tie- 2 磷酸化反应及内皮细胞趋化作用，使血管变形和消退。对于成人而言，Ang- 1 与Tie- 2 受体共同保持血管稳定，而血管生成素Ang- 2 的上调可打破这种稳定状态，在这种条件下内皮细胞不再附着于周细胞及细胞外基质，而是在血管生成信号的作用下产生血管形成用。[12]

3.5 血小板衍化生长因子 血小板衍化生长因子可在体内诱导血管形成，但不直接影响内皮细胞增殖，在创伤愈合过程中起促进形成功能性血管的作用。血小板衍化生长因子受体的表达只位于部分内皮细胞上，大部分是形成过程中的内皮细胞管及微血管内皮细胞，但静息期内皮细胞表面无表达。目前认为血小板衍化生长因子在血管形成的后期起作用，是成纤维细胞和平滑肌细胞生长迁移的刺激剂，但对内皮细胞和神经细胞的作用并不显著。

3.6 骨形成蛋白 BMP(Bone Morphogenetic Protein 骨形成蛋白)不仅具有较好的骨诱导活性，而且能上调成骨细胞中VEGF 的表达，具有显著的促血管生长作用。而VEGF 亦能调结成骨细胞的活性，使之能更好的分泌细胞基质从而促进成骨[13]。Bouletreau 等[14]认为，在骨缺损修复过程中，成骨细胞表达VEGF，其促进内皮细胞的分裂增殖，进而促进血管形成，同时VEGF 促进内皮细胞表达BMP- 2，BMP- 2 作用于成骨细胞，一方面可提高VEGF 的表达，另一方面可以促进骨再生；两者之间形成一个正反馈调节。李建军等[15]发现BMP- 2基因转染使人骨髓基质干细胞血管内皮细胞生长因子表达增加，但是骨形态发生蛋白是否有促血管形成作用目前尚有争议。

3.7 其他因子 其他因子如胰岛索样生长因子、肝细胞生长因子等，他们的促血管形成机制尚不完全清楚。

3.8 促血管生长因子在组织工程组织血管化中的应用促血管生长因子促进血管形成，可以加速血供，但在实际应用中存在下列问题：因子半衰期过短，代谢降解过快，不能持续足够时间。因子易被代谢流失不能在局部形成有效浓度，因此，目前已从血管生成因子治疗技术向基因治疗技术方面发展。

4. 促进组织工程骨血管化的方法

目前促组织工程化骨血管化的技术主要有6 种

4.1 包裹血管束法 Vacanti[16]等将复合有成骨细胞的可降解材料包裹体内血管束，由血管束长出毛细血管深入材料内，形成带血管蒂的人工骨，再用于移植。

4.2 预构带血管蒂的组织工程化骨肌骨瓣法Levin[17]等根据骨缺损区形状与大小设计好羟基磷灰石HA 支架材料，骨形态发生蛋白复合物HA+BMP植入带有轴心血管的肌肉组织内，4 周后预构成带血管蒂的组织工程化骨肌骨瓣，再将其植入自体骨缺损区。

4.3 带血管蒂筋膜包裹法 植入组织工程化骨时，就近选择带血管蒂的筋膜瓣包裹移植物，使其表面弥漫的毛细血管能够从各个方向长入移植物内。[18]

这些方法是借用体内已经存在的血管条件来促进人工骨的血管化，手术效果明确；但存在增加机体额外创伤、受局部血管条件限制等缺点，从而限制了其临床推广应用。

4.4 应用血管内皮细胞EC 将EC 联合成骨细胞与支架材料复合，使EC 作为血管生成的种子细胞，在体内成骨活跃的微环境中发生毛细血管化，使材料内形成弥漫性的内源性微血管网，并与宿主血管系统建立吻合[19]。由于成骨细胞与EC 在体外联合培养时，相互促进功能蛋白的表达，从而为该技术的进一步研究奠定了基础，但作为种子细胞的来源较困难，自体细胞不易获取，体外扩增能力有限，异体细胞存在免疫原性而较难应用。

4.5 应用促血管生成的生长因子 如采用生长因子缓释技术将血管内皮细胞生长因子VEGF 吸附于支架材料内，或者通过基因转染技术促进细胞进入体内后大量分泌，依靠局部较高浓度的VEGF促进微血管生成[20]。目前这类方法也存在不足，如VEGF 与材料在复合制备时，现有技术往往造成其生物活性大大下降，另一缺点是VEGF 局部含量不易调控，由于生长因子对血管生成的作用是网络式的序贯作用，因此单一因子的低含量作用效果是有限的，而高含量VEGF 作用有诱发血管瘤的危险。

4.6 联合应用法 也有将上述方法部分联合应用的尝试，以最大限度的提高血管化的速度，如杨志明[21]等植入由复合材料、rhBMP、成骨细胞制备的组织工程化骨，修复兔骨缺损时，发现人工骨包裹带血管蒂筋膜及复合EC 的方法具有明显的促血管作用，其效果强于人工骨单纯复合EC 或单纯包裹带血管蒂筋膜的方法。

5. 血管化对组织工程骨成骨的作用

5.1 大块组织工程骨组织的血管再生，依靠周围组织血管长入速度太慢，所需时间较长，可能在尚未建立新的血循环之前，复合在材料上的成骨细胞已死亡。金丹等[18]在骨组织工程实验研究中分析证实影响骨组织再生成功与否的决定因素是移植物的再血管化。体外培养构建的组织工程化骨组织复合物，其营养供应模式是培养液—细胞，植入体内后则变为血液- 细胞间液- 细胞。营养供应方式的改变势必影响复合物中细胞的增殖、分化和分泌功能，造成成骨能力下降。因此，尽早建立血运，才能更多保留复合物的成骨活性。王坷等[22]在组织工程骨植入大型动物体内的实验中发现，材料细胞复合体的中心部分虽然也复合了细胞，但并未成骨。分析原因，可能是材料中心缺乏种子细胞所需的液体交换条件，而血管血供又无法在短期内长入，提示大体积组织构建中血管和血液供应的重要性。如同其它组织移植一样，组织工程骨也面临植入后迅速血管化的关键问题[23]。只有尽早建立血运，才能更多保留复合物的成骨活性，保证组织工程骨再生成功。Sahota 等[24]认为组织工程植入物失败的主要原因在于血管化的迟滞，因此如果不能建立有效第三部分血管束与感觉神经束联合构建血管神经化组织工程骨作用研究血循环，组织工程材料的制作只能被限制在薄、小的程度。

5.2 Hanahan[25]认为血管生成受血管生成促进因子和血管生成抑制因子的共同调控，生理状况下血管生长受到严格调控，当正负调控因子失去平衡时则会出现病理性血管生成。促进血管生成的因子主要VEGF(血管内皮细胞生长因子)、bFGF(basic Fibroblast Grow th Factor，碱性成纤维细胞生长因子)、ANG(血管生成素)，PDGF (Plateler-Derived Grow th Factor，血小板衍化生长因子)，TGF- β(Transform ing Grow th Factor- β，β- 转化生长因子)，EGF(Epidermal Grow th Factor，表皮细胞生长因子)等，抑制血管生成的因子有血管抑素、内皮抑素、血小板因子- 4 等[26]，VEGF 能诱导血管形成在骨牵张过程中血管形成和基质矿化有着密不可分的关系，VEGF 可通过增强血管内皮细胞和前成骨细胞的增殖和分化而加速骨形成，其中VEGF 是较特异地作用于EC 的多功能细胞因子，具有高度保守性，两个相同亚基以二硫键交联结合成二聚体糖蛋白。它是血管生成初期最重要的促进因子：首先，通过肝素样分子的调节，VEGF与相应受体结合引起受体自身磷酸化，激活丝裂原活化的蛋白激酶，选择性增强，有丝分裂，刺激EC 增殖并促进血管生成；此外，升高血管尤其是微小血管的通透性，为细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供营养[27]。最近对VEGF 的调控机制研究发现，细胞在低氧含量或某些癌基因产物作用下可产生缺氧诱导因子- 1(Hypox ia- Inducible Factor 1，H IF- 1)，它是一种转录因子，可明显促进VEGF 基因的表达，促进VEGF 的生物活性[28]，包括120ku 的α 亚基和91- 94ku 的β 亚基，β 亚基与细胞的多种功能有关，而α 亚基则仅与O2 能量代谢有关，调控的靶基因包括VEGF、促红细胞生成素(Epo)、PDGF、bFGF、NO、内皮素- 1 等，相应的产物协同作用，从而改善缺氧态，Reyes[29]等发现骨髓来源的间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem，BMSCs)不仅诱导产生成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，而且在VGEF- B 作用下，还可以向血管母细胞、EC 表型分化，表达CD34、CD31、Ⅷ因子等。

5.3 Nom i[30]等介绍了在工程化组织中复合血管化因子、植入内皮细胞和在复合细胞前基质材料进行预血管化处理等血管化构建方法。裴国献[31]强调组织工程骨血管化的重要性，主张用各种方法重建组织工程骨的血液循环，介绍了显微外血管束植入技术、筋膜瓣包裹术在组织工程化骨组织再血管化中的应用和植入病损区前在身体适当部位对组织工程骨进行血管化预构技术的应用价值。Hokugo等[32]用生物可吸收膜将自体松质骨颗粒复合骨髓后包裹在隐血管束周围进行异位成骨试验，三周后观察到有新骨形成，并在骨组织中看到有新生血管穿过。

5.4 带血供骨移植体带有相当数量的有生命活力的细胞与基质成分，能促使更快地与宿主骨融合。更重要的是作为一块有生命的组织，能与宿主即刻建立血管化联系，使其能够通过自身同宿主一致的神经、体液调节系统，较快纳入与宿主一致的生理反馈模式中，成为机体的有机组成部分，进而成为一个完整意义上的有生命的组织，能更积极地对内、外环境中各种因素变化(包括营养状态、应力刺激等)作出同机体整体功能相适应的反应。这对于构建有生命活性的组织工程化人工骨是一个重要启发。已经证实，促进组织工程骨内的血管再生、加快组织工程骨的血管化过程可以提高成骨速度与成骨质量[33]。

综上所述，现行的组织工程骨构建方法多仅使用单纯成骨细胞接种，使之虽然能够成骨，但无论从形成新生骨组织的数量还是质量上来讲均不能满足临床修复大范围、长段骨缺损的需要。因此如何在构建组织工程化骨组织的同时，促进小血管的长入以及细胞与材料复合物内血供的重建就成为骨组织工程由基础向临床应用的关键性环节。同其他类型移植骨一样，充分的血液供应是保证组织工程骨组织体内存活的决定性因素。如何在构建组织工程骨组织的同时重建其血液供应，已成为骨组织工程从基础研究向临床应用过渡的关键性问题。小块组织工程骨植入体内后，早期依靠组织液可获得营养，大块或管状组织工程骨仅靠组织液渗透营养是不完全的。因此，研究组织工程骨血管化构建技术具有十分重要的意义。大量的基础实验和临床应用研究证实影响骨组织再生成功与否的决定因素之一是成血管化。

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