法洛四联症与FOG2基因研究进展

邓展涛 章文文 综述 易龙 审校

（南京大学，江苏南京 210046）

法洛四联症与FOG2基因研究进展

邓展涛 章文文 综述 易龙 审校

（南京大学，江苏南京 210046）

法洛四联症（TOF）是最常见的发绀型先天性心脏病，发病率为1／3000，占所有先心病的10%，严重危害患儿健康。FOG2基因编码一种富含锌指结构的蛋白，与转录因子GATA4相互作用调控心脏锥干的发育。FOG2基因敲除的小鼠拥有类TOF样的心脏畸形，被认为是TOF的一种易感基因。TOF的形成和锥干发育异常有关，研究证实FOG2基因突变可以导致TOF。对ZFPM 2／FOG2基因的研究可以帮助我们了解法洛四联症的病因，也可能促进法洛四联症的基因诊断和基因治疗。

法洛四联症；FOG2基因；GATA4

法洛四联症（tetralogy of fallot，TOF）是最常见的复杂先心病，新生儿发病率为1／3000，占先心病的10%［1］。TOF包括4种最基本的病理改变：主动脉骑跨、室间隔缺损、肺动脉狭窄和右心室肥大。TOF的临床表现严重，甚至导致死亡，随着医学的发展，通过安置人工补片外科治疗大大提高了TOF患儿的生存率。然而，0.5%～6%的患儿术后由于室性心动过速而猝死。事实上，即使缺口得到修复，用于修复的补片可能会引起心脏变形，影响右心室的正常收缩功能［2］。

组织学上，TOF是胚胎心脏发育神经嵴细胞相关的锥干发育缺陷，第二心区心前细胞增殖、迁移和分化异常所致［3］。该区域含有表达GATA4蛋白的心前细胞，细胞迁移到原始心管的动脉极，影响锥干的发育和心肌壁的形成［4］。

迄今为止，TOF的病因仍然不清楚，一般分为遗传类和非遗传类的。非遗传类的原因有环境致畸因子、孕前感染以及感染性疾病［5］。尽管数十年来，国际上专注于预防这些因素，但是这些非遗传类因素种类越来越多而且更加多样化。先心病的基因研究状况同样也发生了变化。最初的遗传研究方法只有很低的分辨率，分析先心病的遗传形式受到了限制。考虑到先心病高死亡率和低生育率的比例，故早期的先心病的家系分析，都是偏向于简单的畸形，比如室间隔缺损（V SD）和房间隔缺损（A SD）。但随着先心病患者健康状况的改善和基因组研究技术的发展，消除了对研究对象的局限。当代的技术为先心病患者进行广泛的基因分析提供了丰富的机会，研究发现一些基因的突变与TOF的形成有关。

1 ZFPM 2／FOG2基因的发现和结构以及编码蛋白

GATA转录因子是在哺乳动物中造血（GATA-1／2／3）和心脏发生（GATA4）中重要的调节因子。GATA蛋白通过与其他转录因子的相互作用共同调控GATA蛋白的转录活性。Friend of GAT A4（FOG）是一种能与GATA1相互作用并能调控GATA1的转录活性的锌指蛋白，1999年，Svensson等［7］在小鼠中克隆出另外一种FOG相关蛋白基因（FOG2基因）。他们发现FOG2基因编码的FOG2蛋白位于8q22，含8个外显子，包含1151个氨基酸，拥有8个锌指结构域，在结构上与FOG蛋白高度同源。在小鼠的胚胎中，FOG2基因最先在心脏和膈肌中表达，随后，该基因广泛表达于小鼠的心脏、大脑和睾丸组织中。该研究组实验结果提示小鼠FOG 2基因可以参与调节不同的中胚层细胞谱系的分化，并且在心脏发育过程中起到明显的调节作用。

2 FOG2基因的表达和功能以及人类心脏的形成

1999年，Svensson等［7］研究发现小鼠FOG2蛋白能在体内和体外与GATA4的N端锌指特异性相结合。通过特异性结合，FOG2能调节GATA4的转录活性，因为在小鼠胚胎成纤维细胞和大鼠的心肌细胞中，FOG2基因的表达能抑制Gata4依赖性的转录过程。2000年，该研究组运用基因定位突变的方法来探究FOG2基因在正常心脏发生中的作用。研究显示FOG2基因缺陷的小鼠在胚胎期的第13天因为充血性心力衰竭而死亡，表现为一种三尖瓣闭锁综合征，包括三尖瓣的缺失、严重的房间隔缺损、室间隔缺损、左心室流出道的延长、主动脉瓣向右移位和肺动脉狭窄。这些FOG2基因缺陷的小鼠在发育中同时也存在着左心室发育不全。该研究展示了FOG2在正常心脏的瓣膜发育中的重要作用以及提示了三尖瓣闭锁综合征的遗传学基础。

2000年，Tevosian等［8］通过敲除小鼠的FOG2基因来获得FOG2-／-小鼠，敲基因小鼠在胚胎形成的中期死亡，表现出严重的心血管畸形，包括共同房室通道、心室肌发育不良、冠状动脉缺失和法洛四联征。另外，在FOG2-／-小鼠的心脏中，冠状动脉发生非常明显的缺失。而使FOG2在心肌细胞中重新表达能修复FOG2-／-小鼠的血管表型，进一步展示了FOG2基因在心肌中的作用以及在冠状动脉的发育中至关重要。

2001年，Crispino等［9］建立了使GATA4蛋白单个氨基酸被取代的小鼠模型，削弱其与FOG2蛋白的相互作用。这些小鼠在胚胎期的第12天死亡，表型与FOG2-／-小鼠相似，除了GATA4突变小鼠还存在半月瓣的畸形和双右室流出道。此项研究提示GATA4的功能依赖于FOG2蛋白和另一种心脏特异性FOG蛋白间的相互作用。

3 FO G2基因突变与TOF的关系

3.1 FOG2基因突变的研究 FOG2基因突变大多是外显子的错义突变、同义突变、移码突变，以及5’UTR区的变异、非编码的外显子的变异、内含子剪接异常、外显子无义突变形成额外的终止密码子和起始密码子造成蛋白的截短或延长等。它的单个或多个基因的突变或异常表达均会导致心血管发育异常，影响心脏畸形的发生。

2003年，Pizzuti等［10］对47个TOF患者的FOG2基因进行测序，在其中2个患者中各发现了1个突变（S657 G、E30 G）。2011年，De Luca等［11］在1个散发的双右室流出道的患者中，同样发现了FOG2基因上E30 G这一突变。2005年，Ackerman等［12］在30个死亡的膈肌有缺陷的儿童中，在4号外显子上发现了一个突变（R112 X），尸体解剖显示患者具有肺发育不良和先天性膈疝。该研究提示FOG2基因这个突变可能会引起原发性的肺部和膈肌缺陷。2007年，Bleyl等［13］在96个先天性膈疝的患者中发现了FOG2基因7号外显子上的2个突变（M 703L、T843 A）。2012年，Tan等［6］在1个双右室流出道患者中发现了同样的突变（M 703L）。2011年，De Luca等［11］在1个散发的双右室流出道的患者中发现了FOG2基因6号外显子的一个突变（I227 M），另外，在1个散发的TOF患者中，在FOG2基因8号外显子上发现了另外一个突变（M544I）。2012年，Tan等［6］在1个双右室流出道合并室间隔缺损的新生儿中发现了FOG2基因8号外显子上的一个突变（K737E）

到目前为止，国内外主要报道了13种导致先天性心脏病的FOG2基因突变，其中大多数都发生在多个不相干的家庭。而导致法洛四联症的突变有3种：E30 G、S657 G、M 544I。其中S567 G和M 544I仅见于TOF患者，E30 G除了见于TOF患者外，还可以见于双右室流出道的患者中。

2012年，我国赵明等［21］通过对106例TOF患者FOG2基因编码区的突变或单核苷酸多态性位点的检测，在16例不同患者FOG2基因的2、6、8号外显子上，分别发现多个位点基因的改变，并将新发现的基因改变位点在110名健康人中进行验证，证实其改变位点均为突变位点。V60E、E44 V突变点位于N端转录表达结构域上，V339I突变点位于第3锌指结构域上，N868S突变位点位于第7锌指结构域上。另外，在外显子8上还发现5个已知的SNPs：rs11993776、rs16873732、rs16873732、rs35998713、rs1442320。

近年来，国内外对于FOG2基因与法洛四联症的研究开始发生停滞，原因是虽然确定FOG2基因突变与TOF的发病具有相关性，但是其中的机制却缺乏一个能得到普遍认同的解释，加上近年来的研究也没有对FOG2基因对TOF的作用有新的提示与猜测。另一方面也增加FOG2基因与TOF关系与作用的可研究性。

3.2 FOG2基因突变导致法洛四联症的可能机制

随着人们对FOG2基因结构以及在心脏发育中的表达有了一定的了解，更多的研究方向转向FOG2基因的功能和调控机制。

1999年，Pehlivan等［14］通过FISH分析发现一些基因型为del（8）（D23.1）的先天性心脏畸形患者，而8p23、l的中段缺失包括FOG2基因。这提示FOG2基因单倍体功能不全可能是一些先天性心脏畸形的病因学基础。

2001年，Crispino等［9］运用基因定点突变技术改变GATA4的氨基端和FOG2结合的氨基酸，表现如基因敲除小鼠。研究发现在TOF患儿中存在FOG2基因突变，在正常对照人群中没有发现。推测FOG2／GATA4转录复合物的变异在TOF患者心脏发育过程心前细胞的异常迁移和行为发挥作用。了解心脏前体细胞的行为，可以对以后不影响心脏血液动力学的外科修复提供临床支持。

2003年，Pizzuti等［10］在47例TOF患者中发现2个FOG2基因编码区的突变（S657、E30 G）。为了检测突变是否改变FOG2蛋白的功能，运用谷胱甘肽-S-转移酶GSTPull-dow n试验结合T NT系统体外转录和翻译突变蛋白（Pro mega，Madison，W I），SDS-PAGE检测FOG2-GATA4复合物。研究证明，FOG2突变蛋白并没有影响GATA4与FOG2蛋白的结合。随后，为了研究突变的FOG2蛋白是否保留影响GATA4转录活性的能力，利用荧光报告基因试验检测GATA4的表达，发现E30 G突变的FOG2蛋白与野生型的FOG2蛋白对GATA4的抑制作用并无明显差别，而S657 G突变的FOG2蛋白与野生型的FOG2蛋白相比，对GAT A4的抑制作用则有所降低。研究提示FOG2基因突变，虽然不影响FOG2蛋白与GATA4蛋白的结合，但却可能通过降低FOG2蛋白对GATA4的抑制作用，影响GATA4的转录活性，而GATA4基因是一种在早期心脏发育过程中起作用的锌指转录因子，GATA4基因敲除小鼠不能形成腹侧心管。通过这样的机制，最终导致TOF和其他心血管畸形的形成。

类似的，2006年，Nemer等［15］在26例TOF患者中发现了1个GATA4第一个锌指区域上的突变（E216D），这个突变同样不影响GATA4与FOG2蛋白的结合，以及GATA4与DNA的结合，但却降低了下游目标基因的转录活性。

无论是FOG2基因的突变还是GATA4基因氨基结合区域的突变，都不影响两者的结合，但却降低了FOG2基因对GATA4的调节作用，可能通过这样的机制，最终影响了心脏的发生，导致了TOF的形成。当然，现在对于FOG2和GATA4基因的研究还不够深入，需要更多的研究与实验进一步阐述FOG2基因的变异导致TOF发生的机制。

4 FOG2基因拷贝数量变化（CNV）与TOF的关系

4.1 拷贝数量变化（CNV）与人类疾病 拷贝数量变化（copy nu m ber variation，CNV）是由于基因组重排导致的主要结构变异类型，包括亚显微结构下大于1kb基因片段的缺失和重复。CNV被认为是影响人类疾病的主要遗传因素之一，突变频率比单核苷酸多态性（SNP）高的多。CNV证实与孟德尔遗传疾病、散发性疾病和复杂疾病的易感性有关，通过改变相关基因的剂量产生临床表型［16］。各种机制参与CNV的形成，主要分为2大类：以DNA重组为基础和DNA复制为基础。

2010年，美国WTCC（The Wellco me Trust Case Control Consortium）协会运用全基因组关联研究（GWAS）对8种常见病的16 000例患者进行拷贝数量变化（CNV）的检测。发现并证实克罗恩病、1型糖尿病的患者中存在拷贝数量变化（CNV）的改变［17］。类似的，先天性心脏病也极有可能与拷贝数量的变化存在极大的关系。

4.2 Alu序列介导的外显子缺失和重复常常导致疾病的发生 Alu序列是哺乳动物基因组中短分散重复序列家族（SIN E）的一员，约有50万份拷贝。

也就是说平均4～6 kb中就有1个Alu序列。灵长类动物基因组中的许多Alu序列为不等同源重组事件提供了大量的机会，Alu序列也就成为了重组的热点。这些重组事件如果发生在染色体内，导致1个基因中外显子的删除或复制，当它们发生在染色体间时，会引起更复杂的染色体异常如易位或重排。现已发现人类许多疾病由Alu重复序列之间的不等同源重组引起的，如R B1基因缺失引起的神经胶质脑瘤、Dystrophin基因重复引起的Duchenne肌营养不良。Alu介导的突变大概占了人类遗传病的0.3%［18］。

4.3 TOF患者中存在FOG2基因拷贝数量变化（CNV）的猜测 1991年，Gelb等［19］发现大约38%的8号染色体重组综合征患者患有TOF，其中1个染色体断裂点位于8q22，FOG2基因所在区域。2005年，Ackerman等［12］在1位先天性膈疝和肺发育不良的患者中发现一个无义突变（R112 X），突变位于锌指结构功能区前，由于生物体内存在无义突变导致的m RNA降解，该突变相当于缺失一份等位基因。虽然从国内外的报道中，TOF患者中FOG2基因的拷贝数量变化（CNV）都还没有阳性发现，但从人类基因组数据库中，发现FOG2基因也富含Alu序列，据此，推测FOG2基因的CNV在TOF患者中是存在的，但是占的比例为多少，需要进一步研究。

4.4 TOF患者中拷贝数量变化（CNV）的检测方法

目前，主要作为检测点突变而开展的方法，如测序和变性高效液相色谱法，一般不能检测拷贝数的变化。目前发展了很多检测CNV的方法，Southern blot分析将揭示许多畸变，但不能发现小缺失，并且不是理想的常规技术；实时荧光定量PCR，可以检测特点良好的缺失和扩增，但由于1个反应只能针对1个位点，要准确地定位缺失位点还很麻烦；荧光原位杂交技术（FISH）使用特异性探针同细胞中期分裂相的染色体（或DNA纤维）杂交，能显著提高结构变异的清晰度，但由于工作量巨大，且不能检测到较小缺失重复片段的单一基因畸变；比较基因组杂交技术（CGH）适用于整个基因组的研究筛选，但成本高，技术复杂；多重连接探针扩增技术（MLPA）是最早由荷兰学者Dr.Schouten JP［20］于2002年提出，是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术，它利用简单的杂交（hybridization）、连接（ligation）及PCR扩增（PCR am plification）反应，于单一反应管內可同时检测40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。MLPA在检测CNV变化尤其是基因内的缺失和重复具有很大的优势，检测从DNA提取、反应至结果分析仅需2天。此外，因为所使用的反应条件都相同，所以在相同的操作条件下MLPA技术有不同的应用，可以平行处理不同的检测项目。

5 检测FOG2基因变异的临床意义

2011年，Tan等［6］通过对FOG2基因与TOF发生的特异性和敏感度分析显示，虽然其灵敏度不高，但有较高的特异性，据此可以为FOG2基因在TOF的产前诊断和基因治疗提供依据。

FOG2基因是心脏发育过程中较早表达的转录因子，与GATA4相互作用贯穿心脏发育的全过程，在心脏的发育中发挥重要的作用。该基因发生变异将可能导致先天性膈疝、法洛四联症（TOF）或双右室流出道（DORV），对于妊娠期的妇女，特别是带有明显家族史的妇女，通过抽取产前绒毛组织或羊水，进行FOG2基因筛查，结合胎儿超声心动图的检查，提早发现心脏发育异常的胎儿，争取早期治疗和终止妊娠的机会，减轻家庭负担和社会负担。

6 结 语

迄今为止，国内外研究对FOG2基因的结构、功能和在心脏发育中的表达已经有了一定的了解，也发现了多种FOG2基因的变异。但FOG2基因导致突变的机制仍未得到普遍的认可。预测FOG2基因中存在拷贝数量变化（CNV）至今也还没有阳性报道。而且国内对FOG2基因的研究由于研究样品小，所发现的突变是否为我国TOF的功能性致病位点，还需要进一步的研究与证实。

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编辑：宋文颖

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2013-07-12）