杉木炭疽病拮抗菌HY32的筛选及其应用

路宗岩 周国英 陈玉华 闫法领 闫瑞坤 伍南

（中南林业科技大学林学院，长沙 410004）

杉木（Cunninghamia lanceolata）是我国南方主要的丰产速生用材树种，在江西、湖南、四川等多个省（区）均有种植［1］。炭疽菌是一种地理位置分布广泛、寄主繁多的真菌，可侵害多种树木，尤其对一些丰产速生林可以造成严重危害［2，3］。杉木炭疽病是杉木种植区主要发生病害，几乎有杉木的地方就有炭疽病发生，且以低山丘陵地区人工幼林更严重，常大面积发生。病轻时会导致杉木幼苗的针叶或嫩梢变褐枯萎，严重时常会造成杉木幼林成片的枯黄、枯死，对其造成了毁灭性的损害［1-3］。该病菌的抗药性很强，目前防治杉木炭疽病的化学杀菌剂都很难防治该病［4，5］。因此需要寻找一种高效安全的防病方法，来控制和预防该病在杉木上的扩散。利用生防细菌或其代谢产物防治植物病害，使寄主植物周围的有益和有害微生物达到平衡，从而起到防病增产目的，已经成为国内外在生物防治研究中的热点话题［6，7］。本课题组在湖南攸县杉木生产基地分别采集感病和健康的杉枝，分离获得杉木炭疽病病原菌，筛选出一株高效防治杉木炭疽病的拮抗菌，旨在为杉木炭疽病的防治提供菌种资源，并为其有效的生物防治打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

病原菌取自攸县发病杉木枝条，典型病状的新鲜杉木炭疽病枝。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与鉴定

1.2.1.1 病原菌的分离与形态特征观察 从攸县采集发病杉木枝条，取典型症状的新鲜杉木炭疽病枝，用组织分离法进行病原菌的分离，采用常规法进行纯化和保存。将保存菌种接种在PDA平板上，28℃培养，观察菌落形态和颜色及其显微形态，照相记录。参照真菌形态学鉴定手册［8］，初步判断分离所得菌的种类。

1.2.1.2 病原菌的致病性测定 使用科赫法则对分离菌株进行致病性测定［9］。

1.2.1.3 病原菌rDNA-ITS的扩增与序列分析 采用常规CTAB法［10］用DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取病原菌基因组DNA。将DNA产物送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行纯化测序。并把测序结果与GenBank数据库中已知序列进行blast同源性检测分析。利用MEGA5软件以rDNA-ITS相似序列构建系统发育树。

1.2.2 炭疽病拮抗细菌的分离与筛选

1.2.2.1 叶表细菌的分离与纯化 采集健康杉枝，用无菌水过夜浸泡杉叶，用稀释法分离杉叶表面细菌，28℃培养、48 h 后记录菌量，并根据菌落形态、颜色和大小选取，并进行纯化，共分离6个批次细菌。采用常规法进行纯化和保存。

1.2.2.2 拮抗细菌的筛选 初筛：采用平板对峙法［4］，将培养6 d的病原菌菌丝块（d=6 mm）接种于PDA平板中央，采用十字交叉法在离菌块中心30 mm处接种待测内生菌，每菌株接种4点，以接种灭菌培养基为对照。每次试验设置3次重复。28℃恒温培养36 h后，测量病原菌菌落直径和抑菌带宽度，计算拮抗菌对病菌菌丝生长的抑菌率。

复筛：采用发酵法［11］进行复筛。将初筛选出的拮抗菌株分别在NA培养基（牛肉膏蛋白胨固体培养基）上培养 2 d后，接种到50 mL NB培养液（牛肉膏蛋白胨液体培养基）的三角瓶中（250 mL），28℃、180 r/min摇床振荡培养 48 h。发酵液用0.22 μm细菌过滤器过滤得到发酵滤液，将滤液与约50℃ PDA 培养基按 1∶19混匀倒入平板，冷却后在平板中央放入d=6 mm的炭疽菌菌饼，4 d后测量病菌菌落直径，以无菌水为对照。每次试验设置3次重复。

1.2.2.3 拮抗细菌抗菌谱的测定 采用平板对峙法［4］，在离病原菌菌块中心3 cm处接待测拮抗细菌，接种4点；以中央只接病原菌，周围不接生防菌做对照；28℃培养6 d。每处理3次重复。记录拮抗菌对各供试病菌的抑菌效果。供试4种病原菌，即油茶炭疽病、油茶软腐病菌、油茶根腐病和油茶叶枯病菌（由经济林培育与保护教育部重点实验室提供）。

1.2.2.4 室内盆栽试验 对杉木幼苗进行室内盆栽试验。取拮抗菌发酵液（菌体浓度>6.0×1010CFU/mL），用无菌水稀释成100倍、500倍、1 000倍3个梯度，用喷洒的接种方法进行杉木炭疽病的防治试验。先在保湿条件下接种供试病原菌，48 h后在植株上喷施拮抗菌的发酵液，25℃保湿条件下培养。设置2个对照，CK1用无菌水，CK2用75%多菌灵500倍稀释液作为对照。每处理3株，重复3次。逐株记录病情，并计算发病率和病情指数。杉木炭疽病病情的分级标准参照曾大鹏等［12］的报道。

2 结果

2.1 炭疽病病原菌的鉴定结果

2.1.1 病原菌的分离与形态特征观察 从感病针叶的病健交界处分离纯化到一株明显优势菌落，命名为CSUFTCC F0101。该菌于28℃培养6 d后，菌落呈圆形，直径达70.00 mm左右，正面为灰白色，背面呈浅墨绿色并有同心轮纹；随菌龄增加颜色逐渐加深；菌丝疏松绒毛状，气生菌丝发达，菌落表面有桔红色的分生孢子堆（图1）。在显微镜下观察其孢子形态：分生孢子梗短，基部色较深，厚壁，有分隔。孢子无色，单细胞，椭圆形，两端钝圆。初步判定该菌是杉木炭疽病的病原菌。

2.1.2 病原菌致病性测定 接种5 d后，杉枝均开始出现不规则的病斑，开始较小呈橙黄色，随后病斑自烫伤处向针叶四周扩展，颜色也变成暗褐色，且针叶上有子实体和分生孢子堆产生。切断针叶后，叶尖端先变黄枯死，然后向下方逐渐扩展到茎，最

图1 杉木炭疽病病原菌菌落特征

2.1.3 病原菌rDNA-ITS的扩增和序列分析结果 用rDNA-ITS的通用引物对ITS1/ITS4对病原菌总DNA进行PCR扩增，将测得的ITS序列与GenBank上的序列进行blast比对，结果表明，CSUFTCC F0101菌株的rDNA-ITS序列与菌株Cg-210（GenBank登录号HQ264179）的相似性高达100%。下载GenBank等数据库中同源性的ITS序列，然后与本试验所测的ITS序列进行对位排列，利用MEGA5软件以rDNAITS 相似序列构建系统发育树（图3）。从系统发育树中可以看出，CSUFTCC F0101菌株与菌株Cg-210（GenBank 登录号HQ264179）和菌株M-50（GenBank登录号JX258798）以95%的置信度聚在一支上，亲缘关系最近。确证该病菌是杉木炭疽病的病原菌，即胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。

2.2 拮抗细菌的筛选结果

2.2.1 拮抗细菌的初筛 试验结果表明，从湖南攸县杉木叶表上共分离获得45株细菌。以杉木炭疽病病原菌为指示菌，筛选出抑菌带宽度≥4 mm 的菌 株 有 10株， 依 次 为 HY2、HY6、HY10、HY13、HY24、HY27、HY30、HY32、HY41 和 HY43（表 1）。

2.2.2 拮抗细菌的复筛 结果（表2）表明，初筛获得的抑菌带宽度≥4 mm 的10株菌经发酵法复筛，其发酵液对供试病原菌的抑制率均>60%，其中以HY32菌株的抑制率最高为81.7%，能够明显抑制病菌的生长。可以看出，在固体培养基与液体培养基中，10株拮抗菌产生的代谢物质的量是不一样的，二者后使整个嫩茎枯死（图2）。其发病症状与自然条件下相同。对照组未出现发病症状。由此推断，该病菌是引起杉木炭疽病的致病菌。间没有对应关系。菌体本身的拮抗活性明显比拮抗菌的无菌滤液高，因为拮抗菌HY32不论是菌体本身还是菌株培养物的无菌滤液，都能有效抑制杉木炭疽菌的生长，故将HY32作为杉木炭疽病的拮抗菌株，进行下一步的试验。

图 2 接种 5 d 后杉木枝条的发病症状

图3 CSUFTCC F0101的rDNA-ITS系统发育树

2.2.3 拮抗菌HY32的形态特征 拮抗菌HY32菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上生长，菌落呈乳白色，圆形或近圆形，边缘较整齐，表面湿润，且有金属光泽，菌落直径一般2-3 mm，培养初期菌落中央有褶皱产生，随着菌龄的增加，褶皱逐渐消失，最后变成液体状。在显微镜下观察发现，菌体杆状，芽孢端生，革兰氏染色阴性（图4）。

表1 拮抗细菌对杉木炭疽病菌的抑制作用

表2 拮抗细菌发酵液对杉木炭疽病菌的抑制作用

图4 HY32的形态特征

2.2.4 抗菌谱试验结果 表3表明，拮抗菌HY32对供试的4种植物病原真菌，即油茶软腐病、油茶炭疽病、油茶根腐病及油茶叶枯病均有抑制作用，菌丝生长抑制率为58.2%-71.4%。其中，对油茶炭疽病菌、油茶软腐病菌的抑菌效果较好，抑制率分别为71.4%和65.9%。可见，拮抗菌HY32对植物病原真菌具有较广谱的拮抗活性，有很好的生物防治应用前景。

表3 拮抗菌HY32对不同植物病原菌的抑制作用

2.2.5 室内盆栽试验结果 盆栽试验结果（表4）表明，通过初筛、复筛得到的潜在生防菌株HY32，实现了预期的生防效果，对杉木炭疽病有较好的防治效果，使其病情指数明显降低。发酵液100倍稀释液的防治效果比化学农药多菌灵好，500倍稀释液的治疗效果是61.7%，100倍稀释液的防治效果是65.4%。与对照多菌灵比，拮抗菌HY32的发酵液对杉木炭疽病的防治效果有明显优势。

表4 HY32发酵液对杉木炭疽病的盆栽防治效果

3 讨论

随着环境恶化和致病菌耐药性的增强，从自然界中分离筛选植物病害生防菌，具有广阔的研究及应用价值，应进一步的加强研究。拮抗菌活性一般以抑菌带的宽度作评价指标，但抑菌带并不能很好地反应拮抗菌的抑菌效果，因为拮抗菌的抑菌效果和抑菌带宽窄不完全成正相关，所以本试验利用平板对峙法和发酵液法筛选拮抗菌株，并在杉木幼苗上进行测试。

笔者从杉木叶片表面分离到的生防菌HY32对杉木炭疽菌有较强的拮抗活性，初步鉴定该菌株为芽孢杆菌。芽孢杆菌是植物微生态中的优势种群，有较强的防病抗菌作用，分布广泛、易分离与培养，且其芽孢对酸碱度、高温等外界因素的抗逆性较强，所以在加工微生物菌剂和选择剂型上，产芽孢细菌比非产芽孢细菌（如假单胞菌）有更多优势，更适于生产加工和贮藏［14-16］。在试验过程中特别注意了生防菌HY32发酵液的使用，发现新鲜发酵液具有较稳定的防治效果；反之，将其放置一段时间后，防治效果则不理想，这可能是发酵液的活菌数、菌活力及其代谢物质会随时间发生变化，从而影响其防治效果。该菌株发酵液原液的防病效果要比其他浓度的好，因此其优化培养条件尚待研究。另外，拮抗细菌用作控制病原菌的方式大致有拮抗作用、竞争作用、寄生作用、诱导系统抗性等［17］，生防菌HY32的抑菌结果是造成病原菌菌丝扭曲、断裂、膨大、抑制孢子萌发等，与卢丽俐等［11］对油茶炭疽病，郝华坤等［19］对棉花黄、枯萎病的抑菌结果基本一致。虽然该菌对杉木炭疽病具有一定的防治效果，但是不太稳定，是否能应用于生产，还需要对该菌的作用机制、定殖能力等作进一步的系统研究。

4 结论

本试验从杉木炭疽病叶分离到了CSUFTCC F0101菌株，通过科赫法则与分子鉴定，结果表明，该菌株为杉木炭疽病的致病菌（胶孢炭疽菌）。以该病菌作为指示菌，将从杉木叶片表面分离到的45株细菌，经过平板对峙初筛，筛选到10株对杉木炭疽菌有较强抑菌活性的菌株，在进一步的发酵液复筛，筛选到一株对杉木炭疽菌具有明显拮抗效果的菌株HY32，其发酵液对杉木炭疽菌的抑制率为81.7%，通过培养形状和形态观察，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。在室内盆栽试验中，HY32菌株的防治效果达到60%以上。另外，该菌具有一定的广谱抗性，对油茶炭疽病菌、油茶软腐病菌、油茶根腐病菌、油茶叶枯病菌均有较强抑制作用，尤其对油茶炭疽病菌的作用显著，抑菌率达到71.4%。

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