抗乙型肝炎病毒单克隆抗体药物的临床前药效学评价

李蒙，孙桂芹，王蕾，陈力

复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是世界范围内的一个重要公共卫生问题，是导致慢性活动性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌的最主要原因之一，每年有近100万人死于与HBV感染有关的各种肝脏疾病[1]。我国是乙型肝炎大国，HBV携带者约占全国人口的7%[2]。HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)阳性母亲的新生儿[3]和免疫功能低下的人群[4](如肝移植受者)是HBV感染高危人群。HBV疫苗通过主动免疫方式对HBV易感人群提供安全、有效的免疫能力。与此互补，肌内注射乙型肝炎免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin，HBIG)实现了被动免疫，提供了针对HBV接触后的快速、短期保护。HBIG在阻断母婴传播(与HBV疫苗联用)、防止肝移植患者HBV再感染及突发情况应急处理方面有广泛应用[5-7]。但HBIG作为血液制品，有以下缺点：①接受治疗的患者尤其是免疫功能低下者，存在感染潜在未知病原的可能；②除HBV表面抗体(抗-HBs)外，产品中还存在其他抗体和蛋白，反复使用有造成免疫复合物疾病的可能；③高效价抗-HBs的血液供者来源有限。因此，通过体外抗体工程制备针对HBsAg的人源(或人源化)抗HBV单克隆抗体(简称单抗)替代HBIG很有必要，是未来的发展趋势。

动物抗体的人源化和人源抗体是抗HBV单抗药物研发的2条主要途径。人源化抗体是通过鼠源抗体的人源化改造获得，一般保留鼠源抗体的互补可变区(complementarity determining region，CDR)及部分骨架区，产品仍含有5%～10%的鼠源序列。现有多个人源化抗体已被美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准上市。人源抗体的技术如噬菌体抗体库技术[8]、免疫球蛋白基因克隆技术[9]、人淋巴细胞移植小鼠[10]等已成熟，而全球第1个人源抗体阿达木单抗(adalimumab)已经在2002年上市。尽管如此，抗HBV单抗药物研发进展缓慢，主要原因是其功能评价系统还不成熟，增加了效果研究和质量控制的难度，限制了筛选效率，从而降低了研发进度。

药物临床前常规评价主要包括药效学评价、毒理学评价及生产和质量控制(图1)。HBIG临床前评价已有评价标准和流程[11]，且有多个上市产品。由海外公司研发上市的产品有HepaGam B(Cangene公司)、HyperHEP B(Talecris Biotherapeutics公司)、Nabi-HB(Nabi公司)和Bayhep B(Bayer公司)等；国产的上市产品有由上海生物制品研究所、华兰生物工程股份有限公司、成都蓉生药业有限责任公司等生产的HBIG。目前为止，重组抗HBV单抗药物还没有上市产品，其临床前评价体系也有待建立。

HBIG是血液制品，有传染HBV、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、人类免疫缺陷病毒1/2型(human immunodeficiency virus types 1 and 2，HIV1/2)、人T细胞病毒(human T lymphotropic virus，HTLV)、细小病毒B19等的可能， 所以HBIG的生产工艺强调病毒灭活过程 (有机溶剂/表面活性剂法和膜过滤法)。此外，还要对聚合物、细菌内毒素、抗补体活性等指标进行质量控制。而重组抗HBV抗体由通用工业生产细胞株表达，质量控制时会关注DNA残留、抗生素残留、蛋白纯度等。另外，抗HBV单抗的糖基化检测也很重要。

红色框内为建议用于评价抗HBV抗体药效学的功能性试验

图1抗HBV抗体药物临床前评价示意图

Fig.1 Schematic representation of preclinical evaluation of anti-HBV antibodies

在毒理学评价方面，因为已有很多经过相似工艺生产并含有相似成分的免疫球蛋白在人体安全应用的经验，血源性HBIG一般不需进行动物毒性评价；而抗HBV单抗需进行毒理学评价，包括急性毒性、长期毒性、遗传毒性、生殖毒性及免疫毒性试验等。

药效学评价是整个临床前评价的核心。HBIG是通过阴离子交换层析和超滤方式纯化人血浆蛋白成分获得的，主要成分是IgG，所以认为其作用与人循环系统中的IgG相同，只需对其抗-HBs效价进行评价(不低于100 IU/ml)。抗HBV单抗在药效学评价中也需评价其抗-HBs效价，但仅抗-HBs效价高是远远不够的。本实验室筛选的高效价抗HBV单抗中，有几株在后续功能性评价(与HBsAg形成抗原抗体复合物及血清病毒清除试验)中并没有很好的效果(数据未发表)。因此，相比HBIG，重组抗HBV抗体在临床前药效学评价中需进行更多研究。本文主要介绍抗HBV单抗研究中用到的药效学评价方法。

1 体外功能评价

1.1 细胞感染评价体系

虽然HBV的研究已有半个多世纪的历史，但迄今尚未建立有效的细胞感染模型。目前常见的研究体系如下所列。

1.1.1树鼩细胞感染模型该模型在1996年由Walter等[12]首次报道。利用该系统，德国的Glebe等[13]发现HBV的Pre S1蛋白在感染树鼩肝细胞中起重要作用。最近，李文辉等[14]借鉴Walter等报道的树鼩肝细胞体外培养方法，提供了钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白为HBV功能性受体的相关证据。但是，影响树鼩原代肝细胞HBV感染模型感染成功率的因素较多，实验的可重复性需提高，目前还不宜用于抗HBV单抗的功能性评价。

1.1.2人原代肝细胞感染模型研究表明，HBV可高效感染人肝细胞[15,16]。但由于人肝细胞来源有限，批次间差异性大，评价HBV单抗极少用到该细胞模型。

1.1.3 HepG2细胞感染模型HepG2细胞是一种人肝肿瘤细胞，无法自然感染HBV。但通过人工转染病毒基因，可实现HBV转录和复制。如HepG2.2.15细胞株，即用2个头尾相连的HBV DNA全基因的重组质粒转染受体细胞HepG2而成。作为HBV复制细胞模型，HepG2.2.15细胞株及其他转染特定目的HBV DNA的HepG2细胞株广泛应用于拉米夫定[17]、替诺福韦[18]、阿德福韦酯[19]等核苷类似物和中草药[20]的抗病毒评价。Paran等[21]用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)处理HepG2细胞，可使HepG2细胞感染HBV；但Gripon等[22]研究不能重复以上现象，说明HepG2细胞感染体系并不稳定，其用于药物抗感染功能评价也未见报道。另外，也有研究报道HBV可感染HepRG细胞[22]，但也存在感染效率低和稳定性差的问题。

1.2 其他体外评价体系

由于缺乏细胞感染评价体系，抗HBV单抗药物的研发明显落后于抗肿瘤单抗及抗其他病毒单抗。为改变这一现况，提高抗HBV单抗药物研发的成药率，人们开展了大量研究，建立了一些有效的功能性评价方法。这些方法的建立和组合，为抗HBV单抗药物的功能性研究提供了新的思路和方法，提高了候选单抗的成药性。

1.2.1常规抗体与HBsAg结合试验HBsAg由226个氨基酸组成，其中的a决定簇为中和表位。虽然HBsAg的三维结构仍不清楚，但结构功能性分析研究表明a决定簇位于亲水区(氨基酸残基99～169位)。根据122位上的氨基酸是赖氨酸还是精氨酸，HBsAg分为d和y决定簇；根据160位上的氨基酸是赖氨酸还是精氨酸，又分为w和r决定簇。因此，HBsAg有4种主要血清型：adw、adr、ayw、ayr。这4种血清型有不同的地理分布[23]。一种单抗可结合的血清型越多，适用的地域就越广。

常规抗原抗体结合试验是采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)的原理和方法实现的，目前实验室常用的有抗原夹心法和抗体夹心法。抗原夹心法是利用未标记的抗原铺板，在捕获待测抗体后，利用标记的抗原检测捕获的抗体。抗体夹心法的过程与此类似。上述方法在临床和基础研究中广为应用。

1.2.2抗HBV单抗亲和力测定抗HBV单抗亲和力(结合常数和解离常数)的测定与其他单抗类似，最常使用的是生物分子相互作用分析仪(Biomolecular Interaction Analysis, BIAcore)。现已报道的抗HBV单抗与HBsAg蛋白的亲和力为3.3×107L/mol(HB48-33)～2×109L/mol(mAb 19.79.5)[24-26]。

1.2.3微粒沉降法将候选单抗与蛋白A 琼脂糖或磁珠偶联后，加入血清，结合血清中的HBV颗粒，通过离心获得抗体微粒/抗原沉淀。沉淀中的抗原越多，表明待评价单抗与HBV结合越好，反映抗HBV单抗潜在的中和能力。此实验中蛋白A 琼脂糖或磁珠为单抗与HBV颗粒的结合提供了人为反应界面，在报道的多株抗-HBs评价中都用到这种方法[24，25]。

1.2.4沉降性病毒/抗体复合物检测在微粒沉降法中，虽然黏附在微粒上的抗体可用于测定抗体在血清中结合抗原的能力，但由于待测抗体与被抗体吸附的抗原是通过微粒沉降，评价条件并不能完全模拟人体血液中游离抗体与病毒结合的状态。针对这一现象，陈力等利用抗体与病毒在血清中结合后形成沉降性病毒/抗体复合物的特点，建立了检测沉降性病毒/抗体复合物的实验条件和方法[27]，并应用于抗HBV单抗药物的筛选。该方法成功模拟了中和抗体在体内清除病毒的过程和能力，且排除了微粒界面、平板界面及蛋白偶联反应引入的干扰，为抗HBV单抗药物的评价提供了一个简单、实用的选择。

2 体内功能评价

鸭模型和土拨鼠模型中的病原体均不同于自然宿主为人的HBV，所以在评价重组抗HBV抗体方面作用有限。猩猩可感染HBV，但考虑到动物来源、价格及伦理，很难广泛应用，一般在其他小动物评价有效的情况下才最后考虑。下面介绍目前几种用于重组抗HBV抗体评价的动物模型。

2.1 HBV转基因小鼠模型

利用各种转基因技术，将不同长度HBV基因导入小鼠单细胞受精卵核内，再植入假孕母体，使之正常发育为可复制、转录表达HBV基因的小鼠，并遗传给后代，此即HBV转基因小鼠。转基因小鼠模型分为HBV部分片段、全长或超长序列等几种模型。仅表达HBsAg而不存在HBV病毒颗粒的HBV转基因小鼠模型有多种。虽然多数模型中不存在HBV病毒颗粒，但表达的HBsAg以亚病毒颗粒形式存在，适用于评价作用靶点为HBsAg的抗HBV抗体。

2.1.1肝特异性表达模型Chisari等[28]构建的转基因小鼠模型中插入的是PreS1、PreS2、S和X基因。该模型利用鼠白蛋白启动子，保证了HBsAg在小鼠肝脏表达的特异性，较好模拟了HBsAg在人肝的特异性表达情况。在这一转基因小鼠模型中HBsAg的表达量不高，但较稳定，也能模拟母婴传播时婴儿体内低HBsAg水平。本实验室应用该小鼠模型，已成功评价了多株人源抗HBV单抗[29]。

2.1.2 HBV高表达模型上海南方模式生物研究中心与复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室合作构建[30]的转基因小鼠模型插入的是线性HBV基因全长，使用的是病毒自身的启动子，HBsAg表达量是Chisari等建立模型的200倍左右，能较好模拟肝移植患者体内的HBsAg水平。该模型不具有肝表达特异性，其HBsAg高表达性与Chisari模型的肝特异性各有优势。

2.2 水动力法注射HBV DNA建立的急性HBV感染小鼠模型

急性HBV感染小鼠模型是利用水动力法对6～9周正常小鼠尾静脉注射含有目的片段HBV1.3质粒而建立的。注射后的第1天，血清中HBsAg和HBV e 抗原(HBV e antigen，HBeAg)均达到高峰，第7天消失。最早出现的抗体是HBV核心抗体(抗-HBc)，然后是HBV e抗体(抗-HBe)，最后才是抗-HBs，这与人感染HBV后急性清除时血清标记的变化顺序一致。病毒颗粒在第1天检测不到；第6天达到高峰，峰值可达106数量级；第20天消失。第7天出现HBV特异性细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)反应[31]。

该模型已用于抗HBV单抗中和小鼠体内HBsAg的研究。韩国绿十字公司的研究显示，该公司研发的3株人源抗体HB48-33、HB48-35、HB48-59在给药24 h和48 h后均能有效将HBsAg降至检出限以下[31]。但是，由于该模型实验操作过程中可变因素较多，小鼠个体间差异大，结果难以重复。

值得一提的是，通过水动力法注射HBV DNA获得的病毒不具有再感染小鼠肝细胞的能力。因此，利用该模型只能观察抗HBV单抗对已合成病毒的影响，而不能观察抗体是否具有阻断病毒感染的能力。

2.3 HBV感染人肝嵌合小鼠模型

可感染人HBV的人肝嵌合小鼠模型是通过某种方式影响小鼠正常肝脏组织生长，再移植人正常肝细胞给小鼠，使人肝细胞在小鼠体内繁殖，形成人肝组织/小鼠肝组织的嵌合小鼠。HBV可感染小鼠体内人肝组织，对这一感染过程的干预可用于抗HBV感染药物的研究。现有人肝嵌合小鼠模型包括Trimera小鼠模型[32]、NOD/SCID小鼠模型[33]、uPA/SCID小鼠模型[34]及Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-小鼠模型[35]。这些人肝嵌合小鼠模型各有特色。Trimera小鼠模型已用于抗HBV单抗17.1.41和19.79.5的研究[24]。但人肝嵌合小鼠模型都不成熟，用于抗HBV感染药物的评价还有待技术和条件的改进。

2.4 HBV感染灵长类动物模型

非人类的灵长类动物(黑猩猩、长臂猿等)可感染HBV，且感染的HBV基因型与感染人类的基本一致[36]。黑猩猩是最早发现能感染人HBV的动物品系，感染HBV后的血清学和肝脏病理改变与人接近。但黑猩猩的使用受来源、价格和伦理等因素的限制。

Kim等[37]利用正常的黑猩猩评价人源化单抗HuS10中和HBV及预防感染的能力。实验组黑猩猩静脉注射5 mg/kg HuS10，3 d后接种人血清HBV；对照黑猩猩注射磷酸缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)3 d后接种人血清HBV。结果表明HuS10可推迟HBV感染。Allen等[17]利用已建立HBV慢性感染的黑猩猩模型对抗HBV单抗(17.1.41和19.79.5)评价时发现，合适剂量的2种抗HBV单抗联合使用可有效降低HBsAg水平，持续数天。

3 抗原表位定位

确定单抗的抗原表位有利于单抗的专利保护及确定应用范围。抗体识别的抗原表位称B细胞表位，分为构象表位和线性表位2种。线性表位由连续的氨基酸序列组成。识别线性表位的待评价单抗能识别变性蛋白上的线性表位。构象表位由空间结构相互邻近的氨基酸或多糖构成，一般存在于天然抗原分子表面，不经加工处理即可直接被单抗识别，蛋白质变性后构象表位消失。

利用蛋白免疫印迹法的变性胶和非变性胶可快速区分待评价单抗的抗原表位是线性还是构象。在变性胶的状况下，抗原分子空间结构改变。如果此时单抗仍能识别抗原，说明是线性表位；如果此时不能识别抗原分子，而在非变性胶的状况下又能识别抗原分子，则说明可能是构象表位。这种方法在单克隆抗-HBs的抗原表位定位中较常用[24,25]。

鉴定线性表位的方法有多种。肽扫描是一种常用方法，主要是合成与靶蛋白氨基酸序列相似的短重叠肽，然后用酶联免疫分析其与待评价单抗的作用及其与待评价单抗结合的程度来预测线性表位。其他方法如氨基酸定点突变技术、噬菌体展示肽技术等都可用来鉴定线性表位。然而，大多数抗原表位是构象表位。Delaney等[18]对单克隆抗-HBs-HB-C7A使用肽扫描技术，没有找到HB-C7A与不同肽段结合的峰值，不能筛选出明确的抗原表位。

抗原抗体复合物的X线晶体学分析确定抗原表位是抗原表位鉴定的金标准。研究表明，大多数抗体的抗原表位是构象表位，由晶体学提供的信息包括抗原抗体复合物分子之间的作用和氨基酸之间的相互作用。但该方法复杂、成本高，且要求有适宜的晶体，所以在单克隆抗-HBs的研究中未见应用。

现报道的大部分单克隆抗-HBs是构象表位，空间结构还不确定；此外，HBsAg有脂成分存在，而这部分脂成分对抗原表位的形成是否有影响还有待进一步研究。

4 结语

单抗技术的成熟和发展为一些临床疾病的治疗打开了新的思路，已广泛应用于治疗自身免疫性疾病、肿瘤、心血管疾病、器官移植等。这些已有的经验是抗HBV单抗药物研发的重要基础。目前，HBV单抗的研发受受体不明、细胞感染模型缺失及动物感染模型成本高等因素制约，进展相对落后。因此，建立简单、稳定、有效的HBV单抗评价体系非常重要。

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