人类免疫缺陷病毒1型慢性感染者B细胞表型分析及抗反转录病毒治疗的修复作用

闫静静，仇超,2,3，李亮助,2，邱趁丽，傅卫辉,2，孙俊，徐建青,2,3，张晓燕,2,3

1. 复旦大学附属公共卫生临床中心，上海 201508； 2. 复旦大学生物医学研究院，上海 200032； 3. 复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032

人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)慢性持续感染的重要特征是随着病毒的持续复制，CD4+T细胞数目逐渐减少，免疫系统功能紊乱，进而造成严重的细胞免疫损伤。与此同时，免疫系统的另一重要免疫应答——体液免疫也出现多种缺陷。最早关于HIV-1感染引起B细胞异常的报道是在1983年[1]，其主要表现为免疫球蛋白血症和对B细胞丝裂原的反应性低，揭示了获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)患者B细胞异常活化和免疫失调等损伤现象。此外，HIV-1感染后机体不能产生有效的抗体应答，最早出现的抗体只是针对HIV-1膜蛋白的非中和表位，而其中和抗体的产生总是滞后于病毒的突变[2,3]，致使病毒不能被有效控制。HIV-1抗体应答的缺陷可能与B细胞的发育过程、分化状态及生发中心的异常变化有关[4-6]。

20世纪90年代，抗反转录病毒治疗(antiretroviral therapy，ART)的临床应用为HIV感染者带来了福音，有效的ART可较好地降低HIV-1病毒载量，增加外周血B细胞数目，并使凋亡敏感B细胞亚群减少而初始B细胞增加，但记忆B细胞数目不能回升[7]，提示ART并不能完全修复HIV-1感染造成的B细胞损伤。因此，明晰ART治疗者的免疫失调状态，可为建立有效的免疫干预策略提供理论依据。

本研究选取中国1995～1996年因有偿献血而集中形成的HIV-1慢性感染人群为研究对象，该人群的人口学特征、遗传背景和病毒分子特征均相近，是研究HIV-1感染与B细胞亚群和表型变化及ART与B细胞亚群和表型修复的极好素材。

1 材料与方法

1.1 研究对象

HIV-1慢性感染者均因1995～1996年有偿献血而感染。分子病毒学分析显示感染的HIV-1毒株是B’亚型，且具有高度同源性。本研究共有66例HIV-1感染者，其中34例经过ART治疗。HIV-1血清学阴性的对照标本来自12名健康志愿者。所有研究对象均按照知情同意原则签署了知情同意书。

1.2 仪器和试剂

人淋巴细胞分离液购自GE Healthcare公司，RPMI 1640培养基和胎牛血清为HyClone产品。荧光抗体无蜕化蛋白同源物(果蝇)〔ecdysoneless homolog (Drosophila)，ECD〕-抗人CD19购自Beckman Coulter公司，PE-Cy7-抗人CD10、PerCp-抗人CD20、PE-抗人CD21、APC-Cy7-抗人CD27、FITC-抗人CD38、Pacific Blue-抗人CD95和 APC-抗人PD-1购自BioLegend公司，APC-抗人CD21 和 FITC-抗人CD40购自eBioscience公司，PE-抗人CD70、V450-抗人Bcl-2购自BD Biosciences公司。固定/穿膜缓冲液为BD Pharmingen产品。淋巴细胞绝对计数管为BD Bioscience公司产品。流式细胞仪购自BD Bioscience公司，型号为FASCAria Ⅱ。

1.3 实验方法

1.3.1标本采集采集HIV阳性患者静脉血，用无菌乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝管收集，共 40 ml。采集后低温运送至实验室用于检测。健康对照组采集静脉血后即刻进行检测。

1.3.2外周血淋巴细胞的绝对计数应用BD Bioscience公司全血淋巴细胞绝对计数管进行外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD19+B细胞的绝对计数，操作方法按照说明书进行。

1.3.3 B细胞亚群及表型分析EDTA抗凝全血用于分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，其原理是应用Ficoll密度梯度离心法。分离的PBMC重悬于RPMI 1640培养基中并计数。取1×106个PBMC进行B细胞染色，染色分为3部分，每部分的染色步骤为先加入CD19抗体，室温避光静置20 min；再加入其他表面抗体混合物，室温避光静置20 min。用含2%新生牛血清(newborn calf serum，NCS)的磷酸缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗细胞。胞内分子染色需先固定穿膜，再加入抗体，按照试剂盒说明书进行。同时做荧光扣除对照(fluorescent minus one，FMO)和单染。流式细胞仪收集的数据用FlowJo 7.6.5版本(Tree Star Inc., Ashland, OR, USA)进行分析。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0进行分析，组间比较采用2组独立样本非参数Mann-WhitneyUtest方法，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 HIV-1慢性感染者外周血淋巴细胞绝对计数的变化

将66例HIV-1慢性感染者分为2组：未接受ART(ART-naïve)组(n=32)和接受ART(ART-treated)组(n=34)。另设HIV-1阴性健康对照组(n=12)。HIV-1感染者均有有偿献血史，感染毒株是HIV-1 B’亚型，6个月以上ART可将病毒载量控制在检测线以下(HIV RNA<50 copies/ml)。HIV-1感染后外周血CD4+T细胞和B细胞绝对数都显著低于健康对照组，而CD8+T细胞显著高于健康对照组(表1)。有效的ART仅能部分恢复外周血淋巴细胞的数目。

表1参与者的基本特征

Tab.1 Baseline characteristics of participants

Healthy controlHIV-1 infectedART-naïveART-treatedCase (n)123234Age (year) #25 (21-32)47.5 (34-66)50.5 (33-70)Male sex (%)505368CD4+ T cell count (cells/μ l)#756 (508-1181)390 (128-950)∗∗390 (73-1 020)∗∗CD8+ T cell count (cells/μ l)#624 (289-913)1 112 (306-3 154)∗∗855 (377-2 516)∗B cell count (cells/μ l)#190 (98-508)125 (26-428)∗180 (40-794)Duration of infection (month)#N/A89 (60-178)89 (13-166)Duration of treatment (month)#N/AN/A29.5 (6-94)HIV RNA (copies/ml)#N/A5 600 (60-110 000)LDL

#Median (range).*P<0.05,**P<0.01 compared with healthy control. LDL, lower than detection level; N/A, not available.

2.2 HIV-1慢性感染者B细胞亚群的异常变化

HIV-1感染后外周血B细胞总数减少，但B细胞各亚群的变化并不一致。为深入探究B细胞亚群的异常变化，根据B细胞表面分子将其分为6个细胞亚群[5](图1A)，通过流式细胞术检测各亚群在外周血中的变化。

健康对照组外周血中的主要B细胞亚群是初始B细胞(naïve B cell)和静息记忆B细胞(resting memory B cell)；HIV-1感染后，其比例显著降低(P<0.05)。此外，未成熟B细胞(immature B cell)和浆母细胞(plasmablast)的比例在HIV感染后也显著减少(P<0.01)。相反，健康对照组外周血中仅少量存在的组织样记忆B细胞(tissue-like memory B cell)在HIV-1感染后比例显著上升(P<0.01)。活化记忆B细胞(activated memory B cell)也显示轻微增加，但无统计学意义(P>0.05)(图1B)。

T1/T2&3, immature/transitional B cell; Naïve, naïve B cell; RM, resting memory B cell; AM, activated memory B cell; TLM, tissue-like memory B cell; PB, plasmablast.

图1 HIV-1慢性感染者B细胞亚群的变化及ART的修复

Fig.1 Distribution of B cell subpopulations in chronic HIV-1 infection and the restoration of ART

比较ART-naïve与RT-treated组发现，ART使初始B细胞比例显著增加(P<0.01)，且异常增加的组织样记忆B细胞比例显著减少(P<0.01)，但静息记忆B细胞仍维持较低水平，未能有效恢复(图1B)。

2.3 HIV-1慢性感染者B细胞表型的变化

2.3.1 HIV-1感染者B细胞中活化分子的表达

高丙种球蛋白血症(hypergammaglobuli-nemia)[1]和多克隆活化(polyclonal activation)[8]是HIV-1感染后B细胞活化的显著特征，但对B细胞各亚群活化分子的表达仍缺乏研究。活化分子CD38表达在HIV-1感染者B细胞中显著增加(P<0.01)(图2A)，且主要表现在未成熟B细胞、初始B细胞、静息记忆B细胞和组织样记忆B细胞中(P<0.01)(图2B)。ART可显著降低未成熟B细胞和初始B细胞中的CD38表达(P<0.01)。

*P<0.05,**P<0.01.

图2 HIV-1慢性感染者、慢性感染治疗者与健康对照者中B细胞及其亚群中CD38的表达

Fig.2 Expression of CD38 on B cells and subpopulations among HIV-1-infected ART-naïve and ART-treated patients, as well as healthy controls

2.3.2 HIV-1感染者B细胞中凋亡相关分子的表达

HIV-1感染造成B细胞部分亚群数目减少，但B细胞不是HIV-1感染的靶细胞，B细胞中凋亡相关分子的表达可能调控感染者B细胞数目的耗损。HIV-1慢性感染者B细胞上调凋亡分子CD95的表达(P<0.01)(图3A中)，同时下调抗凋亡分子Bcl-2的表达(P<0.01)(图3A右)。B细胞各亚群中CD95表达水平均显著升高(P<0.01)，且静息记忆B细胞、活化记忆B细胞和浆母细胞中CD95高水平表达(图3D)，提示这3类细胞可能对CD95-CD95L介导的外源性凋亡途径更敏感。ART可降低静息记忆B细胞和活化记忆B细胞中CD95的表达(P<0.01、P<0.05)，但该表达仍高于健康对照组。抗凋亡分子Bcl-2的表达在初始B细胞、组织样记忆B细胞及浆母细胞中显著下调(P<0.01，图3C)，其表达水平不能经ART恢复。

猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)感染恒河猴的实验已证明PD-1在调节B细胞数目和功能中起重要作用[9]。在HIV-1感染者中，PD-1在B细胞中有上调表达的趋势，但没有统计学差异(P>0.05)，ART也不能降低PD-1的表达(图3A左)。有趣的是，HIV-1感染者静息记忆B细胞和浆母细胞中PD-1的表达水平显著高于健康对照组(P<0.01)，而组织样记忆B细胞中的PD-1表达显著降低(P<0.01)。ART不能修复PD-1的异常表达(图3B)。

2.3.3 HIV-1感染者B细胞中共刺激分子的表达

B细胞的活化需B细胞与T细胞之间相互作用以提供共刺激信号，从而刺激B细胞增殖和分泌抗体；然而有报道称HIV-1感染后B细胞对T细胞依赖疫苗的反应性很低[10]，提示B细胞与T细胞之间的相互作用受到损伤。B细胞中共刺激分子CD40和CD70与CD4+T细胞中的配体CD40L和CD27相互作用，为B细胞活化和分泌抗体提供必要的共刺激信号[11,12]。HIV-1感染者B细胞中的CD40表达上调(P<0.01)，且各亚群中的CD40表达水平均显著高于健康对照组(P<0.01)(数据未显示)。值得注意的是，CD40的表达若以单细胞水平的平均荧光强度(mean fluorescent intensity, MFI)来衡量，HIV-1感染者B细胞及其亚群中CD40的表达水平显著低于健康对照组(P<0.01)。然而，CD40的表达不能经ART修复(图4A)。CD70的表达在HIV-1感染者B细胞中下调(P<0.01)，主要表现在初始B细胞、静息记忆B细胞、活化记忆B细胞和组织样记忆B细胞中(P<0.05、P<0.01、P<0.01和P<0.01)，而ART可上调未成熟B细胞、活化记忆B细胞和组织样记忆B细胞中CD70的表达(P<0.05、P<0.01和P<0.01)(图4B)。

*P<0.05,**P<0.01.

图3慢性感染者、慢性感染治疗者与健康对照者中HIV-1凋亡相关分子在B细胞及其亚群中的表达

Fig.3 Profiles of apoptosis-associated molecules on B cells and subpopulations among HIV-1-infected ART-naïve and ART-treated patients, as well as healthy controls

*P<0.05,**P<0.01.

图4 HIV-1慢性感染者、慢性感染治疗者与健康对照者中B细胞及其亚群中共刺激分子CD40和CD70的表达

Fig.4 Expressions of costimulatory molecules CD40 and CD70 on B cells and subpopulations among HIV-1-infected ART-naïve and ART-treated patients, as well as healthy controls

3 讨论

HIV-1在机体内建立慢性持续感染，致使免疫系统重要功能损伤。随着病毒的持续复制，CD4+T细胞逐渐减少，造成严重的细胞免疫损伤；同时体液免疫系统包括B细胞的功能与抗体产生也出现异常。B细胞在介导抗病毒体液免疫中发挥重要作用，其数目和功能紊乱直接影响有效的抗病毒免疫应答。

初始B细胞和静息记忆B细胞是在体液免疫应答中发挥最重要作用的细胞，然而HIV-1感染造成其数目显著减少。初始B细胞数目的减少可能与病毒载量相关，在ART降低病毒载量后，其数目可恢复至正常水平。静息记忆B细胞可产生针对疫苗抗原(如麻疹、肺炎链球菌和霍乱毒素)的特异性抗体，维持机体的长期血清学记忆。但HIV-1感染者体内这些特异性抗体的水平降低，且与静息记忆B细胞数目减少间接相关[13]，提示HIV-1感染引起机体血清学记忆损伤。然而，静息记忆B细胞数目减少的原因可能与其凋亡敏感性增加有关，本研究发现该亚群中凋亡分子CD95的表达上调使其易经CD95-CD95L介导的外源性凋亡途径发生凋亡；同时，PD-1的高表达造成其数目减少。静息记忆B细胞中CD95和PD-1的高表达可能对其凋亡水平起累加效应[14]。静息记忆B细胞中归巢受体的异常表达使其归巢至淋巴组织[15]及分化发育成浆细胞[16]等都可能是其数目减少的机制，但静息记忆B细胞经ART后仍不能恢复。有报道称早期治疗也能较好地恢复其数目[17]，但一旦形成慢性感染，即使长期治疗也不能恢复其数目。与此同时，外周血中显著增加的一群细胞是组织样记忆B细胞，这类细胞被认为是耗竭型B细胞[18]，其增殖能力低，表位多样性低，抑制性受体表达较高，提示B细胞亚群倾向于终末耗竭状态分化。然而，干扰抑制性受体(如FcRL4和Siglec-6)的表达可提高B细胞增殖及分泌细胞因子的能力[19]，证实HIV-1感染造成B细胞耗竭。ART可显著降低组织样记忆B细胞的数目，但仍高于健康对照组，提示存在病毒载量以外的因素影响该亚群数目。

未成熟B细胞在外周血中是一群过渡型B细胞，其数目与HIV-1疾病进展期外周血CD4计数呈负相关[20]。但本研究发现未成熟B细胞在HIV-1感染后显著降低，这可能与不同研究队列的HIV-1疾病进展阶段不同有关，只有CD4计数严重下降后未成熟B细胞数目才增加[21]。

浆母细胞是终末分化细胞，在感染和疫苗接种时短暂增加并循环于外周血中。有研究报道HIV-1感染后浆母细胞显著增加，并长期维持在高水平，但这些浆母细胞中仅有很少一部分是HIV特异性的，其数目增加可能是高免疫球蛋白血症的机制之一[22]。本研究并未发现浆母细胞增加，可能与疾病进展阶段有关。而且ART不能增加未成熟B细胞和浆母细胞数目。

HIV-1慢性感染不仅造成B细胞亚群比例紊乱，也影响各亚群的活化和凋亡状态。CD38在未成熟B细胞中表达较高，随着B细胞成熟其表达水平逐渐降低，并在B细胞活化后表达重新上调[23]。本研究发现HIV-1感染者B细胞及多数亚群中CD38的表达上调，提示B细胞及其亚群处于过度活化状态。凋亡分子CD95在HIV-1感染者CD21lowCD27+B细胞中高表达[24]，造成该亚群对外源性凋亡途径敏感；而抗凋亡分子Bcl-2在CD10+B细胞中低表达[25]，使其易发生内源性凋亡。SIV感染快速进展的恒河猴中PD-1在记忆B细胞中高表达[9]，降低该亚群数目并影响其分泌抗体能力。本研究发现，HIV-1感染者所有B细胞亚群中CD95的表达均显著上调；所有亚群中Bcl-2的表达都有下调趋势，并在初始B细胞、组织样记忆B细胞及浆母细胞中呈显著性差异；PD-1的表达在静息记忆B细胞和浆母细胞中显著上调，提示CD95、Bcl-2和PD-1的异常表达可能影响所有B细胞亚群的稳态，而不是局限于个别亚群。但ART仅能部分修复CD38和CD95的异常表达，对Bcl-2和PD-1的表达没有显著作用，提示ART不足以修复HIV-1感染造成的B细胞损伤，有效的免疫干预策略亟待开发。

共刺激信号对B细胞的活化和抗体分泌有至关重要的作用，而HIV-1感染后大部分B细胞及其亚群都表达CD40，但CD40的MFI降低，即HIV-1感染造成B细胞及其亚群中共刺激分子CD40的表达降低。有研究表明，HIV-1感染引起T细胞中CD40L的表达降低[26]，CD40和CD40L的表达缺陷可能是造成B细胞与T细胞之间相互作用受损的机制之一。CD70仅表达于活化的B细胞、T细胞和自然杀伤细胞(natural killer ，NK细胞)。体外实验表明，T细胞中CD70可与B细胞中CD27相互作用产生共刺激效应，增强IgG分泌和浆母细胞分化[27]。利用合成的人源可溶性CD27刺激记忆B细胞，发现CD27可与CD70作用，促进转录因子Blimp-1和XBP-1的活化，加快向浆母细胞的分化[28]。本研究结果显示，成熟B细胞亚群包括初始B细胞、静息记忆B细胞、活化记忆B细胞和组织样记忆B细胞中CD70的表达在HIV-1感染后均降低，从而削弱CD70-CD27信号通路，B细胞得不到足够的共刺激信号，影响其功能发挥。

综上所述，HIV-1长期慢性感染造成外周血B细胞数目减少及B细胞亚群异常，且B细胞及其亚群出现过度活化、极易发生凋亡及与T细胞相互作用受损等多种缺陷。ART仅能部分修复B细胞损伤，但无病毒血症患者仍处于免疫失调状态，其体液免疫应答仍不完全，可能增加机会感染和二次感染的易感性。因此，建立有效的免疫干预策略以弥补ART未能修复的B细胞损伤可更好改善体液免疫应答。本研究为免疫干预策略的制订提供了一定线索，首先通过改善初始B细胞和记忆B细胞的凋亡状态，增强其存活能力；其次通过增强CD70的共刺激效应，以提高B细胞产生抗体尤其是特异性抗体的能力。

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