慢性丙型肝炎个体化治疗研究进展

徐佩琦，胡昌明，叶晓光，吴尚为

1. 广州金域医学检验中心有限公司，广州 510330； 2. 天津医科大学，天津 300070； 3. 广州医学院第二附属医院，广州 510260

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)主要经血液传播，呈全球性流行。全世界HCV平均感染率约为3%，我国HCV携带率达3.2%，属高流行区。丙型肝炎起病隐匿，慢性化率高，并与肝硬化、肝细胞肝癌高度相关，是欧美及日本等地区终末期肝病的主要病因，目前无疫苗可用于有效预防[1,2]。因此，早期诊断和及时治疗是控制HCV感染流行的唯一手段。

聚乙二醇干扰素(pegylated interferon α ，PEG-IFNα )联合利巴韦林(ribavirin，RBV)是目前国内外公认的慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)的标准治疗方案，PEG-IFNα -2a或PEG-IFNα -2b均可与RBV联合使用。抗病毒治疗的目的是清除患者体内的HCV，阻止疾病进展。临床治愈标准是获得持续性病毒学应答(sustained virological response，SVR)，即治疗结束时及至少随访24周后患者外周血HCV RNA检测为阴性[3]。但标准治疗方案对临床表现相同的患者群体不能获得同样的SVR；另外，其疗程长达24周或48周，治疗费用昂贵，且可能引起多种不良反应(如IFNα 可引起流行性感冒样症状、抑郁、骨髓抑制、肾脏损害等，RBV可引起溶血性贫血和致畸作用等)，不良反应严重者须减少剂量或停药而达不到治疗效果[2]。

因此，探究哪些因素与HCV抗病毒疗效相关，并根据患者感染情况制订个体化治疗方案，对提高SVR率、避免过度治疗、减少不良反应发生、减轻患者负担等非常重要。本文拟对CHC个体化治疗相关因素及直接抗HCV药物的研究进展进行综述。

1 HCV个体化治疗相关因素

研究发现，病毒和宿主均可影响抗HCV疗效[2,3]。低基线病毒载量及HCV 2、3型感染易获得SVR；40岁以下、女性、低体质指数、无乙醇依赖、肝组织损害轻、无胰岛素抵抗、无合并乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)或人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染等也是获得SVR的有利因素。另外，宿主白细胞介素28B(interleukin 28B，IL28B)基因多态性与HCV的自限清除及标准治疗方案的治疗应答有密切关系[4-14]；宿主肌苷三磷酸酶(inosine triphosphatase，ITPA)基因变异被证实与RBV引起的溶血性贫血相关[15-18]。

1.1 HCV RNA载量

检测基线HCV RNA载量，不仅有助于确诊HCV感染，还可预测患者的SVR。Hadziyannis等[19]将217例1型CHC患者按基线病毒载量分为2组，均接受48周标准治疗方案。结果显示，低载量组(<2×106copies/ml)SVR率为65%，而高载量组(≥2×106copies/ml)为47%。因此，在同基因型HCV感染中，高基线载量不利于获得SVR。2004年《中国丙型肝炎防治指南》推荐，HCV RNA定量 ≥2×106copies/ml者可选择48周标准治疗，而HCV RNA定量<2×106copies/ml者可选择24周标准治疗[2]。

在CHC治疗过程中，除应在治疗开始前检测基线病毒载量外，还应分别在第4、12、24周，决定治疗结束前及治疗结束后24周分别检测HCV RNA载量，以监测治疗效果和调整治疗方案。

目前，HCV定量检测方法以实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)最常用，主要包括TaqMan技术、Amplifluor技术、复合探针法、SYBR荧光染料法等[20]。

1.2 HCV 基因型

1.2.1 HCV基因分型及地域分布特点HCV是单正链RNA病毒，呈高度异质性。根据HCV基因组核酸序列不同，可将其分为不同的型和亚型。根据Simmonds分型系统，HCV可分为6个基因型，70多个亚型[21]。

HCV分型主要采用分子生物学方法，包括测序法、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)技术、线性探针杂交法(line probe assay, LiPA)、基因芯片技术等[18,20]。其中，测序法最经典可靠，被称为“金标准”，但设备要求高、耗时多、成本高，难以在临床大规模开展。RFLP技术具有准确、灵敏、快速、经济等优点，适于临床筛查；但若内切酶种类较少，则只能检测有限的基因型，且无法发现新的基因型。LiPA比常规杂交法具有更高的灵敏度。基因芯片技术能同时实现高通量和自动化。临床实验室应根据需要，灵活选择分型方法。

HCV基因型有明显的地域分布特点[22-24]。HCV 1、2、3型广泛分布于欧洲、美洲和亚洲，美国和欧洲常见1a和1b型，中国和日本以1b、2a型多见，3型主要分布于印度、泰国、印度尼西亚等国家；4型和5型主要在非洲和中东地区；6型主要见于东南亚地区。在中国，HCV 1～6型均有检出，以1b和2a型较常见；其中以1b型为主，占55%～90%；从南到北，2a型所占比例逐渐增加；6型主要见于中国香港、澳门和南方边境地区。近年来，随着人口流动、静脉药瘾者和HCV感染率增加，这种分布情况正在改变，混合感染(常见为1b/2a混合感染)逐渐增多。

1.2.2 HCV基因型与个体化治疗多项研究表明，不同HCV基因型的感染者对标准治疗方案的SVR率不同。与HCV 1、4型感染者相比，2、3型感染者可获得更高的SVR率。感染率最高的HCV 1型感染者接受48周标准治疗方案后, SVR率为40%～54%；2、3型感染者接受24周标准治疗方案后，SVR率为65%～82%，且2型略高于3型[25]。

HCV基因分型可预测SVR，判定治疗的难易程度。在治疗前必须测定患者HCV基因型，并结合其基线病毒载量，制订治疗方案(图1、2)[3,26]。

Low baseline viral load, HCV RNA<400 000-800 000 IU/ml; RVR, rapid virological response; EVR, early virological response; PR, partial response; DVR, delayed virological response; NVR, null virological response; *, Treatment duration reduced for patients with RVR not yet sufficiently studied.

图1对HCV 1、4、5、6型感染者推荐的治疗路线

Fig.1 Recommended treatment procedure for patients infected with HCV genotypes 1, 4, 5 and 6

Low baseline viral load, HCV RNA<400 000-800 000 IU/ml; RVR, rapid virological response; *, treatment duration reduced for patients with RVR not yet sufficiently studied.

图2对HCV 2、3型感染者推荐的治疗路线

Fig.2 Recommended treatment procedure for patients infected with HCV genotypes 2 and 3

1.3 宿主IL28B基因多态性

IL28B又称干扰素λ 3(interferon λ 3，IFN-λ 3)，属IFN-λ 家族。其编码基因位于19号染色体，在机体抗病毒免疫中发挥重要作用。近年来，全基因组相关性研究(genome-wide association study，GWAS)发现，宿主IL28B基因区多个单核苷酸多态性(single nucletide polymorphism, SNP)位点与CHC患者标准治疗方案的治疗效果及HCV的自限清除有关。

Ge等[4]对1 000多例1型CHC患者进行rs12979860位点多态性检测发现，CC型患者的SVR率明显高于CT和TT型(82%vs. 40%)，C基因被称为保护性或应答基因。Suppiah和Tanaka等研究发现[5,6]，rs8099917和rs12980275与标准治疗方案的无病毒学应答(null virological response，NVR)相关，这2个SNP的应答基因分别为T和A，非应答基因型均为GG，rs8099917 GG型患者标准治疗方案的失败率是GT或TT患者的2倍。另外，IL28B基因多态性还与种族分布有关[7]。对rs12979860，东亚人群保护性等位基因的携带率最高(约95%)，明显高于欧洲和非洲人群(71%和42%)。这可解释不同种族的HCV感染者采用标准治疗方案治疗后SVR率的差异。近年来，对我国CHC患者rs12979860、rs8099917和rs12980275多态性的多项研究证实，保护性等位基因携带者的治疗应答率明显高于未携带者，且我国1型CHC患者中保护性基因型频率达80%，提示相比欧美人群，我国1型CHC患者更容易获得SVR[8-10]。

另外，rs12979860 CC型和rs8099917 TT型患者不仅更易获得SVR，还有较高的HCV自限清除率[4,7,11,12]。Rao等[13]对我国CHC患者进行IL28B多态性研究，发现与HCV自限清除相关的SNP有4个：rs8099917 TT (vs. GT)、rs12980275 AA (vs. AG)、rs8105790 TT (vs. CT)和rs10853728 CC (vs. GG)，其中关联性最强的是rs8099917，TT型患者的病毒清除率是GT型患者的15倍。

值得注意的是，因IL28B多态性所致的疗效差异在HCV 1型感染者中表现明显，但在HCV 2或3型感染者中并不明显。Rauch等[14]发现，对HCV 1或4型感染者，rs8099917 TT 型和非TT型感染者的SVR率分别为63%和28%，差异显著；但对HCV 2或3型感染者，SVR率差异不大(80%vs. 86%)。因此，对病毒基因型与宿主IL28B基因多态性的相互作用还需进一步探索。

总之，IL28B基因多态性可预测CHC患者(尤其是HCV 1型感染者)对标准治疗方案的应答情况及病毒自限清除的可能性，有助于制订个体化治疗方案。但对IL28B基因多态性的预测作用还未彻底研究，不能仅据此一个因素决定治疗，而应综合考虑患者自身特点、基线病毒载量、HCV基因型等其他因素。

1.4 宿主ITPA基因多态性

标准治疗方案可引起多种不良反应，其中RBV引起的溶血性贫血较为常见，近15%的患者因贫血严重需减少剂量甚至停药[15]，这势必影响治疗效果。研究表明，位于宿主20号染色体上的ITPA基因变异可保护性抑制RBV引起溶血性贫血的发生。

Fellay等[16]对1型CHC患者ITPA基因区2个SNP位点——rs1127354和rs7270101与标准治疗方案中血红蛋白(hemoglobin，Hb)下降情况进行研究发现，rs1127354为野生型即CC型，该基因型患者与CA/AA型患者相比Hb更易出现下降，A为保护性等位基因；rs7270101为AA型，此基因型患者比AC/CC型患者更易出现Hb下降，C为保护性等位基因。另外，在因贫血需要调整RBV剂量的患者中，突变型患者所占比例也较小，且这2个位点的纯合突变均表现出比杂合突变更明显的保护作用。Naggie等[17]对不同基因型HCV与HIV合并感染者进行研究，也得出类似结论，即ITPA基因变异可防止或减少RBV相关性贫血。

ITPA基因型可预测CHC患者在标准治疗方案中发生溶血性贫血的情况，可用于指导RBV用量调整，为个体化治疗提供帮助。

目前，宿主基因型检测尚未在我国临床实验室普遍开展，如果仅需对特定的基因型如IL28B和ITPA进行检测，可采用测序法、RFLP技术、实时PCR、DNA微阵列芯片技术等。GWAS是高通量SNP检测方法，多用于相关研究[18]。

2 HCV抗病毒治疗新进展

近年来，一些特异作用于HCV复制周期、抑制病毒复制的直接抗病毒药物(direct acting antiviral，DAA)研发成功。目前已上市或正在进行药物临床试验的DAA已超过50种，主要包括非结构蛋白(non-structural protein，NS)3/4A蛋白酶抑制剂、NS5A蛋白酶抑制剂和RNA聚合酶抑制剂等[27]。2011年2种NS3/4A蛋白酶抑制剂特拉匹韦(Telaprevir，TVR)和博赛匹韦(Boceprevir，BOC)在美国和欧洲陆续批准上市，这2种DAA均可联合标准治疗方案对1型CHC患者进行治疗。

Jacobson等[28]发现，对HCV 1型初治患者，特拉匹韦联合标准治疗方案组与标准治疗方案组患者的SVR率分别为75%和44%；且联合治疗组的患者有58%获得了快速病毒学应答(rapid virological response，RVR)，其疗程缩短为24周；但皮疹、瘙痒和贫血等不良反应在联合治疗组出现的频率高于标准治疗方案组。Zeuzem等[29]对HCV 1型经治患者研究发现，复发患者对特拉匹韦联合标准治疗方案的SVR率为88%，无应答患者的SVR率为33%，而对照组(标准治疗方案组)这2类患者的SVR率仅为24%和5%。对博赛匹韦三联疗法的研究表明[30,31]，与标准治疗方案相比，此疗法可使HCV 1型初治患者的SVR率提高至70%，经治复发患者的SVR率提高至75%，无应答患者的SVR率提高至52%，但接受博赛匹韦治疗的患者更易出现贫血和味觉障碍等不良反应。

特拉匹韦或博赛匹韦联合标准治疗方案均可明显提高患者的SVR率，这有助于个体化治疗方案的进一步优化，缩短部分患者的疗程。但三联疗法也面临一些不容忽视的挑战[27-31]，如新的不良反应出现、耐药突变快速发生、对HCV RNA的检测更加频繁、最佳剂量和疗程仍待确定、对其他基因型HCV感染的治疗效果有待评估等。

3 结语

丙型肝炎流行广泛，慢性化率极高，病毒基因组高度变异，是全球性公共卫生难题。HCV感染是病毒与宿主相互作用的复杂过程，个体化治疗方案的制订不能局限于某一个指标，而应从基线HCV RNA载量、HCV基因型、宿主基因多态性、药物剂量选择等多方面综合考虑。

DAA的研发开创了抗HCV治疗的新局面，未来DAA与标准治疗方案联合很可能成为CHC患者个体化治疗的一部分，然而其具体方案的制订、不良反应的控制、耐药危险性与长期疗效的权衡等问题仍有待研究。

[1] Shepard CW, Finelli L, Alter MJ. Global epidemiology of hepatitis C virus infection [J]. Lancet Infect Dis，2005，5 (9): 558-567.

[2] 中华医学会肝病学分会,中华医学会传染病与寄生虫病学分会.丙型肝炎防治指南[J].中华内科杂志，2004，43(7):551-555.

[3] European Association for the Study of the Liver.EASL Clinical Practice Guidelines: management of hepatitis C virus infection [J]. J Hepatol, 2011, 55 (2):245-264.

[4] Ge D, Fellay J, Thompson AJ, Simon JS, Shianna KV, Urban TJ, Heinzen EL, Qiu P, Bertelsen AH, Muir AJ, Sulkowski M, McHutchison JG, Goldstein DB. Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance [J]. Nature, 2009, 461 (7262):399-401.

[5] Suppiah V, Moldovan M, Ahlenstiel G, Berg T, Weltman M, Abate ML, Bassendine M, Spengler U, Dore GJ, Powell E, Riordan S,Sheridan D, Smedile A, Fragomeli V, Müller T, Bahlo M, Stewart GJ, Booth DR, George J. IL28B is associated with response to chronic hepatitis C interferon-alpha and ribavirin therapy [J]. Nat Genet, 2009,41 (10):1100-1104.

[6] Tanaka Y, Nishida N, Sugiyama M, Kurosaki M, Matsuura K, Sakamoto N, Nakagawa M, Korenaga M, Hino K, Hige S, Ito Y, Mita E,Tanaka E, Mochida S, Murawaki Y, Honda M, Sakai A, Hiasa Y, Nishiguchi S, Koike A, Sakaida I, Imamura M, Ito K, Yano K, Masaki N,Sugauchi F, Izumi N, Tokunaga K, Mizokami M. Genome-wide association of IL28B with response to pegylated interferon-alpha and ribavirin therapy for chronic hepatitis C [J]. Nat Genet, 2009, 41 (10):1105-1109.

[7] Thomas DL, Thio CL, Martin MP, Qi Y, Ge D, O′ Huigin C, Kidd J, Kidd K, Khakoo SI, Alexander G, Goedert JJ, Kirk GD, Donfield SM,Rosen HR, Tobler LH, Busch MP, McHutchison JG, Goldstein DB, Carrington M. Genetic variation in IL28B and spontaneous clearance of hepatitis C virus [J]. Nature, 2009, 461 (7265):798-801.

[8] 高晓娟,余祖江,刘翠萍. 白细胞介素28B的基因多态性与干扰素抗丙型肝炎病毒治疗应答的关系[J]. 第三军医大学学报,2012,34(9):832-835.

[9] 徐辉,郭丽琳,何伶俐,陈杨,刘凯,雷秉钧,雷学忠. 宿主白介素28B基因多态性与慢性丙型肝炎抗病毒疗效的研究分析[J]. 四川大学学报(医学版),2012,43(6):855-859.

[10] 陶剑,刘俊,雷华,普东.丙型肝炎患者IL28B基因型和HCV基因型对抗病毒治疗的影响[J].世界华人消化杂志,2011,19(22):2372-2375.

[11] Grandi T, da Silva CM, Amaral KM, Picon PD, Costi C, da Fré NN, Fiegenbaum M, Niel C, Rossetti ML.Response to treatment in Brazilian patients with chronic hepatitis C is associated with a single-nucleotide polymorphism near the interleukin-28B gene[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2013, 108(1):48-53.

[12] Jiménez-Sousa MA, Fernández-Rodríguez A, Guzmán-Fulgencio M, García-álvarez M, Resino S. Meta-analysis: implications of interleukin-28B polymorphisms in spontaneous and treatment-related clearance for patients with hepatitis C [J]. BMC Med, 2013,11:6. doi: 10.1186/1741-7015-11-6.

[13] Rao HY, Sun DG, Jiang D, Yang RF, Guo F, Wang JH, Liu F, Zhang HY, Zhang HH, Du SC, Jin Q, Qin H, Lok AS, Wei L. IL28B genetic variants and gender are associated with spontaneous clearance of hepatitis C virus infection [J]. J Viral Hepat, 2012,19 (3):173-181.

[14] Rauch A, Kutalik Z, Descombes P, Cai T, Di Iulio J, Mueller T, Bochud M, Battegay M, Bernasconi E, Borovicka J, Colombo S, Cerny A,Dufour JF, Furrer H, Günthard HF, Heim M, Hirschel B, Malinverni R, Moradpour D, Müllhaupt B, Witteck A, Beckmann JS, Berg T, Bergmann S, Negro F, Telenti A, Bochud PY, Swiss Hepatitis C Cohort Study, Swiss HIV Cohort Study. Genetic variation in IL28B is associated with chronic hepatitis C and treatment failure: a genome-wide association study [J]. Gastroenterology, 2010,138 (4):1338-1345.

[15] McHutchison JG, Lawitz EJ, Shiffman ML, Muir AJ, Galler GW, McCone J, Nyberg LM, Lee WM, Ghalib RH, Schiff ER, Galati JS, Bacon BR, Davis MN, Mukhopadhyay P, Koury K, Noviello S, Pedicone LD, Brass CA, Albrecht JK, Sulkowski MS，IDEAL Study Team. Peginterferon alfa-2b or alfa-2a with ribavirin for treatment of hepatitis C infection [J]. N Engl J Med, 2009, 361(6):580-593.

[16] Fellay J, Thompson AJ, Ge D, Gumbs CE, Urban TJ, Shianna KV, Little LD, Qiu P, Bertelsen AH, Watson M, Warner A, Muir AJ, Brass C, Albrecht J, Sulkowski M, McHutchison JG, Goldstein DB. ITPA gene variants protect against anemia in patients treated for chronic hepatitis C [J]. Nature,2010, 464 (7287): 405-408.

[17] Naggie S, Rallon NI, Benito JM, Morello J, Rodriguez-Novoa S, Clark PJ, Thompson AJ, Shianna KV, Vispo E, McHutchison JG, Goldstein DB, Soriano V. Variants in the ITPA gene protect against ribavirin-induced hemolytic anemia in HIV/HCV-coinfected patients with all HCV genotypes [J]. J Infect Dis,2012,205 (3):376-383.

[18] 王剑,杨瑞锋,魏来.丙型肝炎病毒基因型及其宿主基因型的检测及临床意义[J].中华检验医学杂志, 2012,35(2):97-100.

[19] Hadziyannis SJ, Sette H Jr, Morgan TR, Balan V, Diago M, Marcellin P, Ramadori G, Bodenheimer H Jr, Bernstein D, Rizzetto M, Zeuzem S, Pockros PJ, Lin A, Ackrill AM, PEGASYS International Study Group. Peginterferon-α 2a and ribavirin combination therapy in chronic hepatitis C: a randomized study of treatment duration and ribavirin dose [J]. Ann Intern Med, 2004, 140(5):346-355.

[20] 毛远丽,王晗,李伯安.HCV 实验室检测方法与临床应用[J].传染病信息, 2012, 25(2):75-79.

[21] Simmonds P, Bukh J, Combet C, Deléage G, Enomoto N, Feinstone S, HalfonP, Inchauspé G, Kuiken C, Maertens G, Mizokami M,Murphy DG, Okamoto H, Pawlotsky JM, Penin F, Sablon E, Shin-I T, Stuyver LJ, Thiel HJ, Viazov S, Weiner AJ, Widell A. Consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotype [J]. Hepatology, 2005,42(4):962-973.

[22] Simmonds P. Clinical relevance of hepatitis C virus genotypes [J]. Gut, 1997, 40(3):291-293.

[23] Agha S, Tanaka Y, Saudy N, Kurbanov F, Abo-Zeid M, El-Malky M, Khalaf M, Ohta N, Yoshizawa H, Mizokami M. Reliability of hepatitis C virus core antigen assay for detection of viremia in HCV genotypes 1,2,3，and 4 infected blood donors: a collaborative study between Japan, Egypt, and Uzbekistan [J]. J Med Virol, 2004, 73(2): 216-222.

[24] Lu L, Nakano T, He Y, Fu Y, Hagedorn CH, Robertson BH. Hepatitis C virus genotype distribution in China: predominance of closely related subtype 1b isolates and existence of new genotype 6 variants [J]. J Med Virol, 2005, 75(4):538-549.

[25] Fried MW, Shiffman ML, Reddy KR, Smith C, Marinos G, Gonçales FL Jr, Häussinger D, Diago M, Carosi G, Dhumeaux D, Craxi A, Lin A, Hoffman J, Yu J. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection [J]. N Engl J Med,2002,347(13):975-982.

[26] Hofmann WP, Sarrazin C, Zeuzem S. Current standards in the treatment of chronic hepatitis C [J]. Dtsch Arztebl Int, 2012,109(19):352-358.

[27] Fontanges T. Management of treatment with direct-acting antiviral (DAA) in clinical practice [J]. Clin Res Hepatol Gastroenterol, 2011,35(Suppl 2): S64-S68.

[28] Jacobson IM, McHutchison JG, Dusheiko G, Di Bisceglie AM, Reddy KR, Bzowej NH, Marcellin P, Muir AJ, Ferenci P, Flisiak R, George J, Rizzetto M, Shouval D, Sola R, Terg RA, Yoshida EM, Adda N, Bengtsson L, Sankoh AJ, Kieffer TL, George S, Kauffman RS, Zeuzem S, ADVANCE Study Team. Telaprevir for previously untreated chronic hepatitis C virus infection [J]. N Engl J Med, 2011, 364(25): 2405-2416.

[29] Zeuzem S, Andreone P, Pol S, Lawitz E, Diago M, Roberts S, Focaccia R, Younossi Z, Foster GR, Horban A, Ferenci P, Nevens F,Müllhaupt B, Pockros P, Terg R, Shouval D, van Hoek B, Weiland O, Van Heeswijk R, De Meyer S, Luo D, Boogaerts G, Polo R, Picchio G, Beumont M, REALIZE Study Team. Telaprevir for retreatment of HCV infection [J]. N Engl J Med, 2011, 364(25): 2417-2428.

[30] Poordad F, McCone J Jr, Bacon BR, Bruno S, Manns MP, Sulkowski MS, Jacobson IM, Reddy KR, Goodman ZD, Boparai N, DiNubile MJ, Sniukiene V, Brass CA, Albrecht JK, Bronowicki JP, SPRINT-2 Investigators. Boceprevir for untreated chronic HCV genotype 1 infection [J]. N Engl J Med,2011,364(13): 1195-1206.

[31] Bacon BR, Gordon SC, Lawitz E, Marcellin P, Vierling JM, Zeuzem S, Poordad F, Goodman ZD, Sings HL, Boparai N, Burroughs M,Brass CA, Albrecht JK, Esteban R, HCV RESPOND-2 Investigators. Boceprevir for previously treated chronic HCV genotype 1 infection [J]. N Engl J Med, 2011,364(13):1207-1217.