实时荧光聚合酶链反应检测性病患者泌尿生殖道沙眼衣原体的临床分析

尤永燕，龚匡隆，龚向东，沙仲，张津萍，孙厚华

中国协和医科大学中国医学科学院皮肤病医院，南京 210042

沙眼衣原体是一类细胞内寄生微生物，其生命周期分为2个阶段，即原体期和始体(或网状体)期[1]。衣原体吸附于敏感细胞的表面受体蛋白，可在淋巴细胞及巨噬细胞中增殖，造成泌尿生殖道感染。在男性感染中，主要表现为非淋病奈瑟菌性尿道炎、附睾炎、前列腺炎和无症状感染等。在女性感染中，主要为宫颈炎、尿道炎、盆腔炎和无症状感染等。衣原体在性传播疾病中的感染作用一直备受关注。为了解沙眼衣原体感染男性和女性泌尿生殖道的临床情况，本研究采用实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测性病患者泌尿生殖道沙眼衣原体，进行临床和实验室分析。

1 材料与方法

1.1 病例

选取2011年我院性病科门诊患者。入选标准：男性和女性患者，18～65岁，无精神病均可入选。共计380例，其中男性216例，最大64岁，最小18岁，平均(35.27±9.29)岁；女性164例，最大60岁，最小18岁，平均(31.95±8.65岁)。均有完整的临床记录。

1.2 标本采集

1.2.1男性尿道取材男性患者尿道分泌物标本应在排尿后1～2 h采集，采用男性拭子插入尿道2～4 cm，转动并停留10 s左右，取出后置无菌管内保存。

1.2.2女性宫颈管内取材先用第1根棉拭子擦拭宫颈管口表面的分泌物，再用第2根拭子插入宫颈管1～2 cm，转动并停留30 s左右，让拭子吸收较多量的分泌物，取出后置无菌管内保存。

1.2.3采样后的处理男性和女性患者拭子采样后，立即接种于淋病奈瑟菌培养基上；同时细胞涂片染色检查多形核白细胞和淋病奈瑟菌，采样拭子置-80 ℃保存备用。

1.3 方法

1.3.1分泌物涂片镜检取材后将拭子在玻片上稍用力滚动1周，自然干燥后加热固定，避免过度加热使细胞变形。标本行亚甲蓝染色，细胞核和淋病奈瑟菌呈深蓝色。在油镜(10×100倍)下观察每视野中的多形核白细胞数(每张玻片标本观察不少于10个视野)。男性患者多形核白细胞数分为≤4个、≥5个和阴性；女性患者多形核白细胞数分为≤9个、≥10个和阴性[2]。

1.3.2淋病奈瑟菌的培养方法淋病奈瑟菌培养采用T-M培养基，35～36 ℃烛缸培养48 h后读结果。

1.3.3 PCR试剂盒PCR试剂盒为中山大学达安基因股份有限公司产品(批号2011006)。

1.3.4实时荧光PCR试验用灭菌0.85%盐水洗脱采样拭子后12 000 r/min离心5 min，弃上清液；沉淀物加灭菌0.85%盐水1 ml混匀，12 000 r/min离心5 min， 弃上清液。沉淀物加50 μ l DNA提取液，充分混匀，100 ℃恒温处理(10±1)min，12 000 r/min离心5 min，取2 μ l上清液进行扩增。自动分析采用核酸扩增实时荧光检测系统(中山大学达安基因股份有限公司，型号DF7600)。

1.4 统计学处理

应用SPSS 15软件，用χ2及Fisher精确检验。

2 结果

2.1 男性检测结果分析

216例男性患者中，尿道多形核白细胞数≥5个者占92.59%，≤4个者占7.41%。淋病奈瑟菌培养阳性122例，阳性率为56.48%。实时荧光PCR检测沙眼衣原体阳性62例，阳性率为28.70%。淋病奈瑟菌合并沙眼衣原体感染30例，合并感染率为13.89%(表1～3)。

2.2 女性检测结果分析

164例女性患者中，87例宫颈管内多形核白细胞数≥10个，占53.05%；77例多形核白细胞数≤9个，占46.95%。实时荧光PCR检测沙眼衣原体阳性33例，占20.12%。滴虫感染4例，占2.44%，其中2例沙眼衣原体阳性。真菌感染8例，占4.88%，沙眼衣原体阴性。164例患者淋病奈瑟菌培养均为阴性(表4)。

表1淋病奈瑟菌阳性和阴性男性患者中多形核白细胞计数

Tab.1 White cell count in male patients with positive/negativeNeisseriagonorrhoeae

≥5n%≤4n%TotalNeisseria gonorrhoeae positive122100.00 00.00 122Neisseria gonorrhoeae negative7882.98 16 17.02 94Total20092.59 16 7.41 216

χ2=22.43，P=0.000.

表2沙眼衣原体阳性和阴性男性患者中多形核白细胞计数

Tab.2 White cell count in male patients with positive/negativeChlamydiatrachomatis(includingNeisseriagonorrhoeaeinfection)

≥5n%≤4n%TotalChlamydia trachomatis positive5995.1634.84 62Chlamydia trachomatis negative14191.56 138.44 154Total20092.59167.41 216

Fisher test,P=0.566.

表3沙眼衣原体阳性和阴性男性患者中多形核白细胞计数(排除淋病奈瑟菌感染)

Tab.3 White cell count in male patients with positive/negativeChlamydiatrachomatis(excludingNeisseriagonorrhoeaeinfection)

≥5n%≤4n%TotalChlamydia trachomatis positive2990.6339.37 32Chlamydia trachomatis negative4979.03 1320.97 62Total7882.981617.02 94

χ2=2.008，P=0.156.

表4沙眼衣原体阳性和阴性女性患者中多形核白细胞计数

Tab.4 White cell count in female patients with positive/negativeChlamydiatrachomatis

≥10n%≤9n%TotalChlamydia trachomatis positive2678.79721.21 33Chlamydia trachomatis negative6146.56 7053.44 131Total8753.057746.95 164

χ2=10.99，P=0.001.

3 讨论

根据生殖道沙眼衣原体感染的临床诊疗与预防[3]，本病的诊断主要依据流行病史、临床表现、实验室检测等，而对实验室检查泌尿生殖道多形核白细胞数量与沙眼衣原体感染的相关性了解甚少。本研究显示，沙眼衣原体感染与泌尿生殖道的多形核白细胞数量相关，在排除淋病奈瑟菌感染的男性患者中， PCR检测沙眼衣原体阳性32例，其中有29例多形核白细胞数≥5个(90.63%)，与沙眼衣原体感染相关(P=0.156，χ2=2.008)；3例多形核白细胞数≤4个(9.37%)，也与沙眼衣原体感染相关。有关女性生殖道宫颈管内多形核白细胞数量与沙眼衣原体感染的相关性目前未见报道。国外文献报道[4]，在性传播疾病中女性沙眼衣原体和淋病奈瑟菌感染的PCR检测率分别为20.5%和30.2%。van Dommelen等[5]采用同一女性患者阴道拭子和尿液标本进行沙眼衣原体PCR检测，阴道拭子阳性率为94%，尿液为90%。Gita等报道[6]，女性沙眼衣原体感染中16.74%为盆腔炎，16.03%为宫颈炎。本研究164例女性患者,沙眼衣原体阳性率为20.12%。33例女性阳性患者中，26例多形核白细胞数≥10个(78.79%)，与沙眼衣原体感染相关(P=0.001，χ2=10.99)；7例多形核白细胞数≤9个(21.21%)，也存在沙眼衣原体感染。4例滴虫感染患者中，检出2例沙眼衣原体阳性，说明滴虫与沙眼衣原体合并感染存在高风险。164例女性患者未培养出淋病奈瑟菌。

2008年，龚匡隆[7 ]等采用沙眼衣原体抗原快速检测试剂盒检测3 000例男性患者，阳性率为12.90%。本研究采用实时荧光PCR检测216例男性患者，沙眼衣原体阳性率为28.70%。比较两种方法，实时荧光PCR检测沙眼衣原体的阳性率提高45%。对淋病奈瑟菌合并沙眼衣原体感染的患者，抗原检测沙眼衣原体的阳性率为21.0%，荧光PCR检测沙眼衣原体的阳性率为24.6%，表明荧光PCR的敏感度高于抗原检测。

引起人泌尿生殖道感染的微生物较多，其他病原体也会引起泌尿生殖道多形核白细胞增多。本研究未对其他病原体进行探讨，主要讨论临床性病发生中的生殖道沙眼衣原体感染。沙眼衣原体可引起上生殖道和下生殖道感染，引起T细胞介导的细胞效应[8,9]。本研究仅采用实时荧光PCR对性病患者泌尿生殖道内多形核白细胞数量与沙眼衣原体感染和淋病奈瑟菌感染的临床相关性进行分析。沙眼衣原体是人泌尿生殖道常见的致病菌之一，主要是性病性淋巴肉芽肿变种(lymphogranuloma venereum，LGV；包括L1～L3，共3个血清型)和沙眼变种[10](包括A、B、Ba、C～K，共12个血清型，D～K主要引起泌尿生殖道感染，其中D、E和F最常见，潜伏期1～3周)。临床表现：男性为出现尿道黏性或黏液脓性分泌物，并伴有尿痛、尿道不适和尿道内瘙痒等症状。女性为感染可持续数月至数年，有症状时可出现宫颈管脓性分泌物和阴道分泌物异常。约50%男性和80%女性均可发生亚临床感染[11]。本研究显示，男性尿道多形核白细胞数≤4个和女性宫颈管内多形核白细胞数≤9个与沙眼衣原体亚临床感染相关，也是沙眼衣原体感染泌尿生殖道的临床特点之一。因此，在性病门诊开展实时荧光PCR检测沙眼衣原体可提高临床检测的阳性率和控制沙眼衣原体的传播。

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