MSCs修饰受体胸腺对异种心脏移植免疫排斥反应的作用研究

朱震 沈振亚 陈海军

[摘要] 目的 大鼠胸腺以豚鼠骨髓间充质干细胞进行修饰，然后行豚鼠到大鼠的异种心脏移植。研究以间充质干细胞修饰胸腺对异种移植心脏存活时间的影响。 方法 供体豚鼠和受体SD大鼠各20只随机分成四组，A组（对照组）；B组（胸腺修饰IT组）；C组（CVF组）；D组（IT加CVF组）。观测指标：移植心脏存活时间，病理变化，供受体异种淋巴细胞毒性试验。 结果 供心平均存活时间：A组（23.20±6.14）min，B组（24.20±9.28）min，C组（335.40±49.23）min，D组（451.00±50.10）min。A与B组两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。C、D组平均存活时间较A、B明显延长，差异有统计学意义（P<0.05）。D组与C组组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。供受体淋巴细胞反应，测得光密度值分别为：D组为（381.20±12.01），A组为（590.20±15.38），胸腺修饰组明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 豚鼠到大鼠心脏异种移植中，豚鼠MSCs修饰大鼠胸腺，当克服HAR后可以延长供心存活时间，但并不能完全克服AVR的发生。

[关键词] 胸腺修饰；异种心脏移植；免疫耐受；骨髓间充质干细胞

[中图分类号] R392.4；R654.2???[文献标识码] A???[文章编号] 2095-0616（2012）21-35-04

Effect of intrathymic inoculation to cardiac xenograft rejection with mesenchymal stem cells

ZHU?Zhen1??SHEN?Zhenya1??CHEN?Haijun2

1.Department of Cardiothoracic Surgery， the First Affiliated Hospital of Soochow University， Suzhou 215006，China；2. Department of Thoracic Surgery， the Affiliated Kunshan Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine， Kunshan 215300， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of intrathymic inoculation with guinea pig's MSCs on the discordant rodent cardiac xenograft in the model of guinea pig to rat xenotransplantation. Methods Donor （twenty guniea pigs） and recipient （twenty SD rats） were randomly divided into four groups， including group A （control group）， group B （IT group）， group C （CVF group）， group D （CVF plus IT inoculation with MSCs group）.The guinea pig's grafted heart mean survival time， the optical density of mixed cell reaction and the pathology were observed. Results MST of group A was （23.20±6.14）min， group B was （24.20±9.28）min， group C was （335.40±49.23）min， and group D was （451.00±50.10）min. The difference between group A and group B was not statistically significant （P>0.05）.Group C and group D were significantly longer than that of group A and group B（P<0.05）. The difference of MST was statistically significant in group D and group C （P<0.05）.The results of MCR of group IT was （381.20±12.01）. Control group was （590.20±15.38）. The optical density of group IT was much lower than control group （P<0.05）. Conclusion Intrathymic inoculation with MSCs of guinea pig can prolong the survival time of xenoheart by using Chinese cobra venom factor.

[Key words] Intrathymic inoculation； Cardiac xenotransplantaion； Immunotolerance； Bone mesenchymal stem cells

选用豚鼠到大鼠心脏异位移植模型作为实验模型。目前超急性排异反应（HAR）已能被中华眼镜蛇毒因子（CVF）所克服，急性血管性排斥反应（AVR）是目前异种移植所面临的主要问题。本研究通过间充质干细胞修饰胸腺来研究该方法对AVR的影响，以了解此方法对异种移植的影响。

1?材料与方法

1.1?主要试剂

Ficoll淋巴细胞分离液（SIGMA公司）；DMEM培养液，胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）；中华眼镜蛇毒因子（CVF）（昆明倍捷公司）；CCK-8细胞计数试剂盒（日本同仁化学研究所）。

1.2?手术材料

二氧化碳培养箱（Heraeus.BB 5060）；8-0无创伤缝线（上海浦东金环医疗用品有限公司）；手术显微镜（YZ 20T-Ⅲ型）；超速冷冻离心机（Juoan MR1812 Inc.France）。

1.3?实验动物

豚鼠选择要求：雄性，健康，体重控制在400～450 g；大鼠选择要求：健康，SD雌性大鼠，体重控制在250～300 g。

1.4?实验方法

1.4.1?全骨髓贴壁筛选法?MSCs分离、培养、扩增。取三色豚鼠四肢长骨，抽取得到骨髓加入Ficoll分离液中进行30 min离心作用；用DMEM液调整吸取到的单个核细胞层中单核细胞密度，按1×106/L的密度分装接种于培养瓶中。在CO2（体积分数为5%）、含饱和湿度的37℃恒温培养箱中对培养瓶进行培养。待细胞生长达到80%融合时进行传代。当这些传代细胞完全融合时得到的即为BM-MSCs[1-2]，然后进行胰酶消化，吹打，制成细胞悬液。

1.4.2?胸腺修饰?大鼠取胸骨上部正中切口，暴露胸腺，胸腺内注射0.1 mL MSCs（1×105个/0.1 mL/次）。用4号针头缓慢注入，常规结扎穿刺点。注射结束后用生理盐水反复冲洗胸腺周围组织。

1.4.3?实验分组?供体豚鼠和受体SD大鼠各20只随机分成四组，每组5只，A组（对照组）；B组（胸腺修饰IT组）；C组（CVF组）；D组（IT加CVF组）。A组做豚鼠到大鼠异位异种腹腔心脏移植，不对受体做特殊处理；B组供体豚鼠MSCs胸腺修饰受体大鼠第15天后，进行豚鼠到受体大鼠异位异种腹腔心脏移植；C组术前24 h受体仅接受CVF预处理，然后行异种异位移植；D组（CVF+IT组）：受体接受供体MSCs胸腺注射及术前CVF预处理，再行异种异位移植。

1.4.4?建立大鼠腹腔异位心脏移植模型（Ono's术式）?采用成熟的改良Ono's术式进行手术，供心采取：豚鼠麻醉，固定，消毒，抗凝，暴露胸腔。保留升主动脉和肺动脉，其余血管均予以结扎。经主动脉反复将供体心脏血液冲洗干净（采用肝素生理盐水），洗后放置冰生理盐水中备用。大鼠麻醉，固定，消毒后进行受体心脏移植，显微镜下进行手术，进腹，将供体心脏的升主动脉与受体大鼠腹主动脉，供心肺动脉与供体下腔静脉行端侧吻合，血管吻合采用二定点吻合法。

1.5?检测指标和术后观察

1.5.1?移植术后供心存活时间的观察?供体移植心脏开始复跳至心脏停跳的时间作为移植心脏存活的时间。术后通过触摸大鼠腹部观察移植心脏是否跳动，视心脏跳动情况，以每2小时、1小时、10分钟为时间段，逐步缩短观察间隔时间。

1.5.2?供体心脏的病理观察?供体豚鼠心脏停跳后立即从腹腔取出，10%甲醛溶液固定供体心脏心肌组织，石蜡包块固定后的心肌组织，并做石蜡切片。光学显微镜下观察染色[常规伊红-苏木素（HE）]后心肌结构的病理变化。

1.5.3?供受体淋巴细胞毒性试验（MLC）?分两组进行淋巴细胞毒性试验：对照组：不做任何处理的大鼠淋巴细胞+豚鼠淋巴细胞；B胸腺修饰组：经供体豚鼠MSCs胸腺注射后第15天大鼠的脾脏淋巴细胞+豚鼠淋巴细胞。首先将豚鼠、大鼠的脾脏制成淋巴细胞悬液，刺激细胞为供体豚鼠淋巴细胞，反应细胞受体大鼠淋巴细胞，丝裂霉素处理供体淋巴细胞，供、受体淋巴细胞均制备成终浓度为1.0×106/mL的细胞悬液。在培养孔中注入均为100 μL的供体刺激细胞和受体反应细胞，在5% CO2，湿度100%、温度37℃的培养箱中培养96 h，加入CCK-8后继续进行4 h的培养后吸取上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）液，在酶标仪上测吸光度（OD）值。根据公式：刺激效应=（实验组OD值-空白对照组OD值）/空白对照组OD值×100%，计算刺激效应。

1.6?统计学处理

采用统计学软件SPSS13.0对数据统计分析，计量资料采用（）表示，进行t检验，计数资料卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2?结果

2.1?MSCs分离、培养、扩增（全骨髓贴壁筛选法）

原代细胞培养约14～16 d后，融合率可达80%～90%，融合后细胞群呈旋涡状，见图1；2代细胞24 h内培养即可呈现完全贴壁形态分布，见图2；3～10代有4～5 d的细胞生长周期，呈现的比较单一的细胞形态，大部分细胞呈梭形，少部分呈多角形，见图3。

2.2?4组大鼠移植心脏的存活时间

移植心脏复跳开始计时，到移植手术后通过腹部触诊心脏停止跳动为止，此段时间为移植心脏存活时间的测定依据。4组大鼠移植心脏存活时间显示，A组平均存活时间最低，B组平均存活时间也较短，但与A组比较差异无统计学意义（P>0.05）。C、D组平均存活时间明显增加，与A、B组比较明显延长，差异有统计学意义（P<0.05）。D组平均存活时间最长，与C组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3?各组豚鼠心肌结构显微观察结果

正常心脏冠状动脉内管壁光整，无中性粒细胞及单核细胞、淋巴细胞附壁、浸润现象，只有少量红细胞附着于管壁上，无明显血栓形成，高倍镜下见小冠状动脉、静脉壁内膜光整无破坏。见图4。

显微镜下观察到A、B两组供体心脏均有HAR现象发生，移植心脏内可见紧密连粘的血栓与管壁，血管内血栓广泛形成，血管外有出血，管壁水肿导致观察到少量的单核细胞，淋巴细胞附壁、浸润，管壁不光整。心肌细胞间血管见血栓形成，内膜不完整，有破坏、突起、增厚，内膜表面见膜样隔离层，见图5。C、D组供心发生AVR，而发生AVR的心脏，导致心肌缺血性梗死现象出现，观察到心肌细胞内有大量的淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞浸润现象，还出现凝固性坏死，有血栓形成于微血管内，血管外少量出血，见图6。

2.4?供受体脾淋巴细胞毒性试验（MLC）

效应细胞为第15天经胸腺修饰后的大鼠脾淋巴细胞，刺激细胞为豚鼠脾淋巴细胞经丝裂霉素处理后的细胞，效应细胞与刺激细胞和CCK-8行单向混合后进行细胞培养。空白组、对照组与胸腺修饰组的MLR测定结果平均值见表2，分别为0.40±0.23、2.76±0.10、1.93±0.03，3组的MLR测定结果呈增殖反应。胸腺修饰组、对照组的刺激效应平均值分别为：381.20±12.01和590.20±15.38，可见胸腺修饰组的受体淋巴细胞刺激效应平均值较对照组显著减弱，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

3?讨论

众多国内外学者的大量系统研究证实，同种啮齿目小动物胸腺修饰后可在心脏移植模型中成功诱导出“永久性、特异性”的获得性免疫耐受[3-5]。其中沈振亚等[6]研究发现异种胸腺修饰后的受体，经过辐射照射后，第7天能抑制IgG类天然抗体的生成。已经有实验证明豚鼠间充质干细胞能够在大鼠胸腺中存活，且豚鼠MSCs在受体大鼠胸腺微环境的影响下，可以向环境中多种细胞分化。从免疫角度看，MSCs本身具有低免疫原性，机体的免疫排斥反应因为这样独特的免疫学特性会降至很低，从而可以更有效的逃避细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞（NK）的杀伤作用[7]；在免疫系统中MSCs具有复杂的调节T细胞和B细胞功能的作用[8-9]，使所在机体的免疫反应降低，表现出一定的免疫调节作用。骨髓MSCs本身具有生长分化可适应性的变化并随环境定向分的特性。Sallusto F等[10]研究结果也证实了这一点，大鼠心肌被注入标记后的MSCs细胞，移植细胞经4～6周后完全分化出与正常心肌细胞及相似的结构，表明间充质干细胞的生长分化随心肌组织微环境发生了适应性的变化，随环境定向分化。

本研究中，研究异种移植排斥反应最常见的动物模型是豚鼠到大鼠的异种移植模型，探讨异种间充质干细胞经过修饰胸腺后能否抑制诱生抗体的产生。选用该模型作为异种心脏移植的实验平台，异种间的研究方向为异种抗原修饰胸腺，由于骨髓中骨髓有核细胞总数的0.001%～0.01%是MSCs的[10]，MSCs本身具有生长分化可适应性的变化并随环境定向分的功能，这是选择修饰胸腺的抗原细胞的基础，MSCs在受体中更能长时间的存在并发挥“驯化”受体T细胞的作用。其次是区别其他胸腺修饰实验，不对受体进行辐射照射，相对而言受体具有温和、低毒等优点，适当的延长胸腺修饰的时间更好的进行阴性选择，这也受益于MSCs能够在受体胸腺中长时间的存活。

笔者认为，豚鼠间充质干细胞的低免疫原性使其能够在大鼠异种环境体内下存活进而分化，是本心脏移植实验的良好的免疫基础。根据其适应性分化特性，MSCs向胸腺间质细胞等具有抗原提呈功能的细胞分化，大鼠T细胞必须在大鼠本身胸腺内成熟发育，根据胸腺的阴性选择机制，T细胞受到豚鼠MSCs及其分化细胞的“驯化”作用，对豚鼠抗原的中枢性免疫产生耐受作用。笔者认为大鼠体内豚鼠间充质干细胞能够生存并参与T细胞阴性选择，主要是MSCs本身具有的相对低抗原性、MSCs有抑制T细胞反应的免疫调节作用，而且胸腺是免疫系统的特区，有可能会因MSCs这两种特性使免疫系统的攻击减少或避免。

本研究单向混合淋巴细胞反应结果可见，大鼠淋巴细胞经供体干细胞胸腺修饰后，相对于供体豚鼠免疫反应受到抑制，对豚鼠来源的抗原反应性明显降低。B组和D组胸腺修饰组中，供体豚鼠脾细胞被大鼠脾细胞刺激后的MLR值明显降低，即针对豚鼠淋巴细胞的应答受抑制；而未胸腺修饰组，大鼠脾细胞和供体豚鼠脾细胞刺激后淋巴细胞反应呈增殖反应，4组MLR值比较来看，A组和C组较B、C组明显偏高，差异有统计学意义（P<0.05）。本研究还可以看到A组和B组供心存活时间两者之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。因为两组均发生了超急性排斥反应，从A组和B组的病理切片中可以明确判断出。单纯胸腺修饰组也发生了，而且程度并未减轻。而C组和D组均使用CVF克服HAR，两者供心呈延迟性异种排斥反应改变的病理特征，且比较典型。表明单纯进行胸腺修饰不能抑制异种移植过程中HAR的产生。

本研究证明在克服超急性排异反应后，胸腺修饰的有效性，但仍然发现胸腺修饰并不能使供心长时间存活。从供心存活时间来看，A、B组的供心存活时间较克服了HAR的D组明显缩短不少，A、B组的供心存活时间同样较克服了HAR的C组明显缩短，但缩短时间要明显少于与D组相比，更将充分证明了本研究采用MSCs胸腺修饰的有效性。研究中未能长期存活的D组的供心，其原因主要可能为AVR中非T细胞依赖性的抗供体抗体的作用，AVR反应中其他免疫细胞，如NK细胞和巨噬细胞的作用等。免疫系统的研究复杂繁琐，类似于网络系统，本研究通过间充质干细胞修饰胸腺来研究该方法对AVR的影响，以了解此方法对异种移植的影响。但要实现理论上本研究单向混合淋巴细胞反应结果可见，大鼠淋巴细胞经供体干细胞胸腺修饰后，相对于供体豚鼠免疫反应受到抑制，对豚鼠来源的抗原反应性明显降低。

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（收稿日期：2012-06-18）