ZBTB5基因真核表达质粒的构建及其在HEK 293T细胞中的表达

姜玉新

(皖南医学院生理学教研室，安徽 芜湖 241002)

BTB(bric-à-brac, tramtrack, and broad)[1]或POZ(Pox virus and zinc finger[2])结构域是一个进化保守的蛋白-蛋白互作结构域，存在于许多调节蛋白[2-3]。人类中有184个已知蛋白含BTB结构域[4]。BTB结构域蛋白与许多关键的细胞进程有关，如凋亡[5]、发育[6-8]、离子通道活性[9]、肿瘤发生[10-11]、转录[11-12]和蛋白降解[13-14]。本实验室前期克隆了一个含BTB结构域的基因ZBTB5，并认为其可能在肿瘤发生以及生殖发育中具有重要的作用[15]，随后，Koh DI等[4]发现该基因可能是一个细胞周期中的转录抑制子和刺激细胞增殖的原癌基因。其结果与我们预期的类似。本研究拟扩增ZBTB5基因完整编码区, 构建其真核表达载体，并在真核细胞内表达，为今后进一步深入研究该基因的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1菌株、细胞和质粒 大肠杆菌DH5α感受态、HEK293T细胞、pET-28a(+)-ZBTB5、pcDNA3.1空载体、pcDNA3.1-GFP载体均为本实验室保存。

1.2试剂 DNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶BamHⅠ和XhoⅠ、质粒提取及DNA电泳凝胶回收试剂盒、兔抗GFP一抗(SKG09)、DNA和蛋白marker、BCA蛋白测定试剂盒、ECL发光试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；HRP标记的羊抗兔IgG(H+L)(ZB-2301)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；引物合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；Mouse anti beta-actin(A00702)购自南京金斯瑞生物科技有限公司；DMEM及胎牛血清购自Gibco公司；HRP-Donkey anti mouse IgG(H+L)(SA00001-8)购自武汉三鹰生物技术有限公司；DNAfect Transfection Reagent(CW0860)购自北京康为世纪生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3基因扩增 根据GenBank公布的ZBTB5基因(NM_014872.2)设计特异性引物ZBTB5F(5-CGCGGA TCCATG GAT TTT CCT GGT CAC TTT GA-3，划线部分为BamHⅠ位点)和ZBTB5R(5-TACCTC GAGTCA CTA GAG CAA AGT GCT GGG AAG-3，划线部分为XhoⅠ位点)。以pET-28(a)-ZBTB5质粒为模板进行PCR扩增，获得全长编码序列。PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色后，在紫外灯下观察结果。

1.4pcDNA3.1-ZBTB5-GFP重组表达载体的构建 将pcDNA3.1-GFP载体和ZBTB5基因的PCR产物用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶回收纯化产物。回收产物摩尔比按1:8(载体:片段)的比例，利用T4DNA连接酶4℃连接过夜，取5 μl连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂于LB/Amp+平板，37℃培养过夜。挑取菌落，接种于含氨苄的LB培养基中，37℃振荡过夜。用碱裂解法提取质粒DNA，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，质粒DNA送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。

1.5细胞转染及观察 胰酶消化HEK 293T细胞，1200 g离心3 min收集细胞，用10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬，铺于6孔板(2 ml/孔)，37℃，5% CO2培养箱中过夜培养至细胞融合度达80%～90%，按照DNAfect Transfection Reagent转染进行转染，操作按说明书进行。46 h后，光镜和OLYMPUS荧光显微镜(488 nm激发)下分别观察细胞并拍照。

1.6蛋白质提取与Western blot鉴定 转染46 h后，弃培养基，PBS清洗2次。胰酶消化细胞，1200 g离心3 min收集细胞，加入0.1 ml Lysis buffer、1 μl蛋白酶抑制剂、1 μl PMSF。将细胞和裂解液转入1.5 ml离心管中，冰上放置10 min。13 000 g、4℃离心5 min，上清转到新的离心管中。用BCA蛋白测定试剂盒和BSA标准品测定上清中的蛋白浓度，操作步骤按说明书进行。

将蛋白定量后，取80 μg总蛋白经10%SDS-PAGE凝胶分离，150 mA 3 h转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h。用Rabbit anti GFP(1∶500稀释)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔(1∶5 000稀释)二抗37℃孵育40 min，TBST洗膜3 次，每次10 min。ECL曝光1 min。内参抗体Mouse anti beta-actin(1∶1 000稀释)37℃缓慢振荡1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min。HRP-Donkey anti mouse IgG(1∶5 000稀释)二抗37℃孵育40 min，TBST洗膜3 次，每次10 min。ECL曝光20 s。

2 结 果

2.1重组表达载体的鉴定 将重组质粒pcDNA3.1-ZBTB5-GFP用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示：其酶切产物获得的目的基因条带约为2 Kb左右(图1)，表明重组质粒构建成功。经测序分析及NCBI-BLAST比对结果与ZBTB5基因编码序列一致。

图1 重组质粒pcDNA3.1-ZBTB5-GFP的酶切分析

2.2报告基因GFP表达的检测 为进一步确定重组表达载体pcDNA3.1-ZBTB5-GFP是否在真核细胞中表达，我们将重组载体转染HEK 293T细胞，并用荧光显微镜观察报告基因GFP的表达情况。结果表明：用pcDNA3.1-ZBTB5-GFP转染HEK 293T细胞后，可检测到GFP，但与pcDNA3.1-GFP转染的细胞相比，pcDNA3.1-ZBTB5-GFP的表达明显降低，而pcDNA3.1空载体对照组未见GFP表达。光镜下可见转染pcDNA3.1-ZBTB5-GFP后，细胞形态正常，与pcDNA3.1空载体对照组和pcDNA3.1-GFP对照组无差异(图2)。

图2 报告基因GFP在HEK 293细胞中的表达检测

2.3ZBTB5蛋白的Western blot检测 为确定ZBTB5蛋白是否也在HEK 293T细胞中表达，我们以GFP为一抗应用Western blot对其检测，结果表明：pcDNA3.1空载体对照组未出现条带，pcDNA3.1-GFP对照组仅出现GFP蛋白条带，而pcDNA3.1-ZBTB5-GFP实验组除了出现GFP条带外，还有一条融合蛋白(ZBTB5+GFP)条带，这说明ZBTB5蛋白亦成功在细胞中表达(图3)。

图3 ZBTB5表达的Western blot检测

3 讨 论

人类基因组中预测有数百个BTB/POZ蛋白(http://btb.uhnl.es.utomnto.ca/db_stats.php)，但功能已知的较少，且在表达调控、细胞分化、发育等过程中发挥重要作用。如PLZF(Promyelocytic Leukemia Zinc Finger protein，或ZBTB16)参与了细胞凋亡、造血细胞的发育与分化、骨骼与神经的发育等生物学功能[16-18]；BCL-6(B-Cell Lymphoma 6，或LAZ3、BCL-5)参与了细胞凋亡、B细胞发育分化、抗炎等[19-21]。我们前期的研究[15]发现，ZBTB5蛋白可能是一个转录因子，可能在肿瘤发生以及生殖发育中具有重要的生物学功能。后来，Koh DI等[4]发现其参与了细胞周期调控。这说明ZBTB5也是一个非常重要的转录因子。从以往研究含BTB结构域蛋白的功能发现，每个BTB蛋白的功能具有多样性，ZBTB5也不例外，如染色体易位导致ZBTB5的第二外显子插入了外源片段，从而导致淋巴瘤[22]。因此深入研究该蛋白的生物学功能，有助于全面揭示其生物学本质，从而为其能否作为因其功能异常所致的疾病的治疗靶点奠定基础。

构建真核表达载体将目的基因转染到宿主细胞内，使其在宿主细胞中持续表达是基因治疗最具应用前景的方法。真核表达载体pcDNA3.1因其5’端含CMV启动子、3’端polyA尾，可高效表达外源目的基因而被广泛应用；同时绿荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)因其性质稳定、不影响外源基因的表达及生物学活性，并可对外源基因的表达进行追踪，从而有利于筛选外源基因和GFP共表达的阳性细胞株[23]。本研究克隆了ZBTB5全长编码基因，并将其插入到pcDNA3.1-GFP载体中，经双酶切及测序鉴定，成功获得了重组质粒pcDNA3.1-ZBTB5-GFP。将该重组载体对HEK 293T细胞株转染后，荧光显微镜下观察GFP的表达发现，pcDNA3.1-ZBTB5-GFP实验组中GFP的表达明显下降，但光镜下的细胞数量未发生改变。其可能的原因是ZBTB5干扰了GFP的表达，从而导致其表达下降，但其具体机制有待于进一步的研究。Western blot发现ZBTB5在细胞中成功表达，为其未来可能用于基因治疗奠定基础。

总之，本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-ZBTB5-GFP，并将其转染至HEK 293T细胞株，荧光显微镜下观察到该融合质粒能成功在细胞中表达。我们将进一步探讨其导致GFP表达下降的机制，为ZBTB5其他的生物学功能揭开其面纱。

[1] Zollman S, Godt D, Prive GG, et al. The BTB domain, found primarily in zinc finger proteins, defines an evolutionarily conserved family that includes several developmentally regulated genes in Drosophila[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(22): 10717-10721.

[2] Bardwell VJ, Treisman R. The POZ domain: a conserved protein-protein interaction motif[J]. Genes Dev, 1994, 8(14): 1664-1677.

[3] Albagli O, Dhordain P, Deweindt C, et al. The BTB/POZ domain: a new protein-protein interaction motif common to DNA-and actin-binding proteins[J]. Cell Growth Differ, 1995, 6(9): 1193-1198.

[4] Koh DI, Choi WI, Jeon BN, et al. A novel POK family transcription factor, ZBTB5, represses transcription of p21CIP1 gene[J]. J Biol Chem, 2009, 284(30): 19856-19866.

[5] Yamochi T, Kaneita Y, Akiyama T, et al. Adenovirus-mediated high expression of BCL-6 in CV-1 cells induces apoptotic cell death accompanied by down-regulation of BCL-2 and BCL-X(L)[J]. Oncogene, 1999, 18(2): 487-494.

[6] Farkas G, Gausz J, Galloni M, et al. The Trithorax-like gene encodes the Drosophila GAGA factor[J]. Nature, 1994, 371(6500): 806-808.

[7] Barna M, Hawe N, Niswander L, et al. The BTB/POZ domain: a new protein-protein interaction motif common to DNA[J]. Nat Genet, 2000, 25(2): 166-172.

[8] Bilic I, Ellmeier W. The role of BTB domain-containing zinc finger proteins in T cell development and function[J]. Immunol Lett, 2007, 108(1): 1-9.

[9] Aravind L, Koonin EV. Fold prediction and evolutionary analysis of the POZ domain: structural and evolutionary relationship with the potassium channel tetramerization domain[J]. J Mol Biol, 1999, 285(4): 1353-1361.

[10] Chen Z, Brand NJ, Chen A, et al. Fusion between a novel Kruppel-like zinc finger gene and the retinoic acid receptor-alpha locus due to a variant t(11;17) translocation associated with acute promyelocytic leukaemia[J]. EMBO J, 1993, 12(3): 1161-1167.

[11] Maeda T, Hobbs RM, Merghoub T, et al. Role of the proto-oncogene Pokemon in cellular transformation and ARF repression[J]. Nature, 2005, 433(7023): 278-285.

[12] Lin RJ, Nagy L, Inoue S, et al. Role of the histone deacetylase complex in acute promyelocytic leukaemia[J]. Nature, 1998, 391(6669): 811-814.

[13] Geyer R, Wee S, Anderson S, et al. BTB/POZ domain proteins are putative substrate adaptors for cullin 3 ubiquitin ligases[J]. Mol Cell, 2003, 12(3): 783-790.

[14] Kwon JE, La M, Oh KH, et al. BTB domain-containing speckle-type POZ protein (SPOP) serves as an adaptor of Daxx for ubiquitination by Cul3-based ubiquitin ligase[J]. J Biol Chem, 2006, 281(18): 12664-12672.

[15] 王炎钦, 姜玉新.ZBTB5基因及其表达特征的初步研究[J]. 泰山医学院学报, 2008，29(1): 1-5.

[16] Brunner G, Reitz M, Schwipper V, et al. Increased expression of the tumor suppressor PLZF is a continuous predictor of long-term survival in malignant melanoma patients[J]. Cancer Biother Radiopharm, 2008, 23(4): 451-459.

[17] Gleimer M, von Boehmer H, Kreslavsky T. PLZF Controls the Expression of a Limited Number of Genes Essential for NKT Cell Function[J]. Front Immunol, 2012, 3: 374.

[18] Wasim M, Mansha M, Kofler A, et al. Promyelocytic leukemia zinc finger protein (PLZF) enhances glucocorticoid-induced apoptosis in leukemic cell line NALM6[J]. Pak J Pharm Sci, 2012, 25(3): 617-621.

[19] Gongol B, Marin T, Peng IC, et al. AMPK alpha2 exerts its anti-inflammatory effects through PARP-1 and Bcl-6[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(8): 3161-3166.

[20] Staudt LM, Dent AL, Shaffer AL, et al. Regulation of lymphocyte cell fate decisions and lymphomagenesis by BCL-6[J]. Int Rev Immunol, 1999, 18(4): 381-403.

[21] Albagli O, Lantoine D, Quief S, et al. Overexpressed BCL6 (LAZ3) oncoprotein triggers apoptosis, delays S phase progression and associates with replication foci[J]. Oncogene, 1999, 18(36): 5063-5075.

[22] Bertrand P, Bastard C, Maingonnat C, et al. Mapping of MYC breakpoints in 8q24 rearrangements involving non-immunoglobulin partners in B-cell lymphomas[J]. Leukemia, 2007, 21(3): 515-523.

[23] Chen X, Wu R, Feng S, et al. Single cell derived murine embryonic stem cell clones stably express Rex1-specific green fluorescent protein and their differentiation study[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 362(2): 467-473.