依达拉奉对血管性痴呆大鼠模型学习记忆能力的影响

周广安 孟光源

(泰山医学院附属泰山医院，山东 泰安 271000)

血管性痴呆(Vascular dementia，VaD)是各种脑血管因素引起的一种认知功能缺损综合征。临床症状主要表现为以下至少三项精神活动受损:语言、记忆、视空间技能、情感、人格和认知功能，病理改变以脑血管病引起的海马等重要部位神经元的缺血缺氧损为主。海马是与学习记忆功能有关的主要脑功能区，易被缺血损伤。研究认为慢性脑缺血可引起海马的细胞凋亡、变性、萎缩，损伤后常常引起学习、记忆功能障碍的出现，为血管性痴呆的病理基础[1]。

血管性痴呆是多种因素参与的复杂病理过程，而氧自由基引起的组织脂质过氧化损伤是其发病重要因素之一。依达拉奉是一种自由基清除剂，通过清除羟自由基，抑制过氧化脂质的生成，从而抑制脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化损伤,是一种有效的脑神经保护剂,血脑屏障的通透率为60%[2]。

为了达到研究其病因机制的目的，建立一种理想的接近于临床VaD发病过程的动模型显得尤为重要。VD建模的方法有许多种，本实验选用易于操作的两血管法建模。研究血管性痴呆大鼠行为及海马组织学变化，以及依达拉奉对其影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 健康雄性3个月龄Wistar大鼠30只，体重250±10 g，清洁级，购于山东中医药大学。

1.1.2药品及试剂 10%水合氯醛、0.9%氯化钠、4%多聚甲醛、10%中性福尔马林。

1.1.3仪器 Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)、分析天平(JA2003)(上海精科)、眼科用手术剪(上海医疗器械有限公司手术器械厂)、眼科用手术镊(上海医疗器械有限公司手术器械厂)、石蜡切片机(德国LE工CARMZ135)、生物组织石蜡包埋机(JBM一A型)(湖北亚光医用电子仪器厂)、自制微创血管夹(湖南医用器械厂)、电热恒温培养箱(Jc303)(上海成顺仪器仪表有限公司)、光学显微镜(德国OLYMPSBX60)。

1.2 实验方法

1.2.1实验动物分组 30只雄性Wistar大鼠室温喂养，随机分为：假手术组、模型组、依达拉奉治疗组，每组各10只。

1.2.2实验模型建立

采用双颈总动脉永久结扎方法。适应性喂养两周后，使大鼠术前12 h禁食，4 h禁水。三组大鼠均用10%的水合氯醛(按3.5 mg/kg给予)腹腔内注射麻醉(为防止针头刺破腹腔脏器，麻醉时使大鼠的位置处于腹部向上，头稍微向下倾斜的头低位。注射时针头在右下腹迅速刺入皮下，沿皮下前进大约0.5 cm后再以45°角缓慢刺入腹腔，回抽如无空气可缓慢注入)。麻醉成功后(以反正反应消失为判定方法)，将大鼠头仰卧固定在鼠板上，用剪刀剪去颈部皮毛，洁尔碘液进行消毒。待消毒液干燥后，沿颈部正中纵向切开皮肤，以能充分暴露视野为准。然后钝性分离开皮下筋膜及肌肉组织至双侧颈总动脉，分离暴露出双侧颈总动脉。模型组与丁苯酞组每侧颈总动脉用0号手术丝线进行双结扎，然后在两丝线中间剪断，缝合手术切口。术后放入有暖灯的箱子中保暖，待苏醒后放回清洁笼箱继续饲养，并给予手术局部皮肤适量青霉素粉剂涂抹3日。假手术组中的除颈总动脉不结扎外，亦按上述手术过程进行操作。

1.3 学习记忆力测试

采用Morris水迷宫法。水迷宫大小为直径150 cm，高50 cm，水深30 cm的圆形水池，池等分为4个象限，平台设于第三象限正中，直径11 cm、高29 cm，水平面高处平台1.5 cm，水温保持在(26±1)℃。水迷宫实验于造模第4 d开始进行，测试程序为定位航行试验(Place navigation):历时4 d，每日2次，将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，设定最游泳时间为120 s，记录在2 min内寻找到并爬上平台的时间即逃避潜伏期(escape latency)。若果大鼠在2 min内未能登上平台，则由实验者牵引其至平台上，让大鼠停留5 s，再放回笼中，潜伏期记为最高分120 s，第5天撤除平台，记录2 min内大鼠的游经平台的次数，进统计分析，以上数据的采集和处理均由Morris迷宫图像自动监视处理系统完成。

1.4 标本采集

造模1周，Morris水迷宫实验结束后，大鼠进行标本采集，用10%的水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，仰卧固定，剪开胸壁暴露心脏，在心尖处插入灌洗针，并同时剪开右心耳，快速入生理盐水冲洗脉管系统，然后用4℃的4%多聚甲醛溶液100～200 ml灌注固定注毕取脑，取脑后固定24 h，后剥取海马组织，并用石蜡包埋、切片、苏木素-伊红染色，封片，在光镜下观察海马组织形态。

1.6 统计分析

统计学数据采用SPSS13.0软件进行分析，数据采用均数±标准差表示。1～4天水迷宫实验结果采用重复测量方差分析，第5天实验数据比较采用单因素方差分析，P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 动物一般情况观察

模型组:大鼠大多数表现为反应迟钝、不干净、进食减少、少动、动作迟缓;个别大鼠出现自发运动增多及自我及相互嘶咬等症状。治疗组与假手术组无明显变化。

2.2 各组大鼠Morris水迷宫行为学观察

进行Morris水迷宫测试结果显示第1、2、3、4天，模型组逃避潜伏期明显大于假手术组，依达拉奉治疗组逃避潜伏期小于模型组，均具有显著差异，有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。治疗组与假手术组逃避潜伏期比较无显著差异(P>0.05)。第5天穿越平台次数，模型组少于治疗组与假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组与假手术组穿越平台次数比较无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 1周各组大鼠逃避潜伏期及穿越平台次数

注：与依达拉奉治疗组对照●P>0.05，与假手术组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

2.3 光学显微镜下观察海马区HE染色结果

假手术组海马区神经细胞排列整齐紧密，形态完整，胞浆丰富胞核饱满，核仁清晰。模型组神经细胞缺失较多，残留的神经细胞排列松散不规则，边界模糊，边缘出现空泡，有的胞核消失。依达拉奉治疗组神经元数目较模型组明显增多，神经元胞浆丰富，核仁清晰(图1)。

假手术组(×100) 模型组(×100) 依达拉奉治疗组(×100)

图1 海马CA1区HE染色结果

3 讨 论

随着世界人口趋向老龄化，VD患者数量在不断增加，已成为继肿瘤、心脑血管病之后引起老年人死亡的第四大疾病，VD也越来越受到广泛关注。因此对VD发病机制和有效防治方法进行研究，具有重要的经济效益和社会效益。

研究表明氧化应激被证实是导致神经细胞损伤的重要原因。活性氧物质的产生，可通过氧化细胞膜脂质[3,4]，并可在鸟嘌呤羟化及胞嘧啶甲基化的过程中引起DNA剪切[5]，而对蛋白质的氧化则可产生羰基衍生物及硝化酪氨酸[6]。活性氧物质还可抑制线粒体电子传递链中的酶复合物，导致线粒体功能障碍[7]，最终破坏细VaD大鼠模型的成功建立对研究其发病机制和治疗方法有着重要的意义，本实验采用2一V0法建立VaD模型，实验整个过程，对动物创伤较小，存活率较高、安全性较好，且手术操作较简单，要表现为学习记忆能力下降，与临床“VaD”的发病过程相似。Morris水迷宫是实验动物学习记忆保持情况的测试方法，被广泛应用于动物行为学的研究[8]。利用Morris水迷宫测试大鼠智能较恰当。

本实验结果发现:采用双颈总动脉永久结扎方法可使大鼠智能下降、相关功能受到损害。利用Morris水迷宫测试，模型组逃避潜伏期明显大于假手术组和依达拉奉治疗组，模型组穿越平台次数明显少于假手术组和依达拉奉治疗组，证明了采用2-V0法造模的VaD模型大鼠学习记忆能力下降，认知功能受到损害;为了进一步肯定模型的成功，对大鼠脑组织进行病理学观察，海马是大脑的重要结构之一，是缺血损伤最敏感脑区是脑内参与记忆贮存功能的重要部分，直接参与信息贮存和回忆，为VaD研究中涉及最的脑区之一，本实验针对海马这一关键脑区行HE染色，结果发现:海马CAI区锥体细的变性、坏死甚至丢失，符合VaD形态学特征，而假手术组与治疗组无明显差异。进一步证明2一V0法造模成功。依达拉奉治疗组大鼠的认知功能的有了明显的提高，海马CAI区锥体细的变性、坏死减少，这与依达拉奉抗自由基的神经元保护机制有关。

采用两血管法制备的VaD大鼠模型认知功能功能下降，海马神经元数量减少，依达拉奉可以改善VaD大鼠的认知功能，保护海马区神经元。

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