对人肠道病毒及其感染的再认识

滕峥，张曦

上海市疾病预防控制中心, 上海 200336

根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)分类，人肠道病毒(human enterovirus，HEV)属小RNA病毒科(Picornaviridae)中的肠道病毒属。HEV在外环境中普遍存在，室温下可存活数日，污水和粪便中可存活数月，冰冻条件下可保存数年。隐性感染者和患者是HEV感染的主要传染源，也是造成疾病传播难以控制的主要原因之一。HEV的流行地区极为广泛。不同种类和型别的HEV感染的流行季节不完全相同，高峰季节为夏秋季。人体对不同种类和型别的HEV亦可重复感染。虽然各年龄段均可受累，但学龄前儿童患者的比例显著高于青少年和成年人。

1 HEV的发现历史及其分类

HEV的分离经历了从灵长类动物开始转至小动物及应用细胞培养技术的漫长过程。1909年，将脊髓灰质炎患者的粪便标本接种于猴子体内，首次鉴定了脊髓灰质炎病毒。1948年，用接种乳鼠方法分离到柯萨奇病毒。1951年，通过细胞培养分离到多种埃可病毒。除与人类健康有关的HEV(包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒)各血清型别外，1969年后研究者又陆续分离出一些抗原性不同于以往的HEV。ICTV决定将从HEV68型起的新型HEV按序号命名。目前世界公认的HEV有近70个血清型[1-3]，100多个基因型[4,5]。

目前，HEV的分类方式有基于血清中和试验的传统分类法和基于HEV-VP1核甘酸序列的基因型别分类法(血清型和基因型分组见表1)。传统分类法经ICTV第8次会议反复修订后，将埃可病毒23型与9型合并为埃可病毒9型，埃可病毒8型与1型合并为埃可病毒1型，柯萨奇病毒A15型与A11型合并为柯萨奇病毒A11型，柯萨奇病毒A18型与A13型合并为柯萨奇病毒A13型，埃可病毒34型与柯萨奇病毒A24型合并为柯萨奇病毒A24型变种，鼻病毒87型重归为HEV68型。埃可病毒10型、22型、23型和HEV72型被划拨到其他病毒属。随着基因检测技术的发展，各国研究者陆续开展用分子分型技术寻找对应HEV血清型的研究，以便能高通量、快速地鉴定。经过近10年的努力，分子分型技术不仅可替代传统的HEV血清型鉴定技术，还可发现变异株和重组株，为HEV基因型别分类和免疫学研究提供了基础。

表1人肠道病毒传统分类和基因分类汇总表[3,5]

Tab.1Traditionalclassificationandgeneclassificationofhumanenterovirus

Traditional classificationVirusSerotypeGene classificationVP1 genotypingSerotypePoliovirus (PV)1-3 (3)HEV-ACVA2-8,10,12,14,16; HEV71,76,89-92 (17)Coxsackievirus A (CVA)1-14,16,17,19-22,24 (21)HEV-BECHO1-7,9,11-21,24-27,29-33;CVB1-6;CVA9;HEV69,73-75,77-88,93,97,98,100,101,106,107 (58)Coxsackievirus B (CVB)1-6 (6)HEV-CPV1-3;CVA1,11,13,17,19-22,24;HEV95,96,99,102-105,109 (20)Echovirus (ECHO)1-7,9,11-21,24-27,29-33 (28)HEV-DHEV68,70,94 (3)New enterovirus68-71 (4)UndeterminedHEV106,108,112,113 (4)

2 HEV的传播途径

HEV在自然环境中长期存在。当携带HEV的粪便污染了地表水、地下水、土壤及生活废弃物时，人类食用的海产品、谷物、饮用水及其他食品就有HEV被富集而受污染的可能。意大利[6]、摩洛哥[7]研究者对蚌进行HEV检测，约在10%蚌标本中检测到HEV。墨西哥研究者[8]对牡蛎进行检测，42%标本HEV阳性。美国夏威夷研究者[9]在9个海滩采样点中6个点的贝类检测到HEV，22份再循环水处理点标本中11份HEV检测阳性。我国深圳龙岗区研究者[10]做了一项外环境水体中HEV的调查，发现水体中HEV总检出率为88.2%。武汉[11]调查结果显示，源水中46%、饮用水中21%检测出HEV。全球脊髓灰质炎监测网络实验室全年对环境中HEV进行监测和评估，尽管许多国家没有报道急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis，AFP)病例，但从环境中可检测到脊髓灰质炎病毒疫苗株。在中国内地，水体中HEV年平均检出率为30%左右。一旦这些被HEV污染的水或食物处理不当就会通过人体口腔、呼吸道、黏膜等进入靶器官复制，引发相应的疾病。近年来，研究者还发现了传播HEV的其他途径。2006年，台湾Chang等[12]从母乳中分离到柯萨奇病毒B3型。2008年，美国Maus等[13]从一位新生儿败血症患儿母亲的母乳中分离到埃可病毒18型，进一步证实母乳也能传播HEV的事实。传播途径的多样性也是HEV难以预防和控制的原因之一。

3 目前常用的HEV检测技术

1950年前，分离和鉴定HEV的方法只有通过动物实验来实现，并分离了脊髓灰质炎病毒和柯萨奇病毒。1950年后，细胞培养技术的发展使HEV研究领域实现了第1次飞跃[14]，也为HEV血清型的鉴定奠定了基础。1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。从此，常见又具有特异临床表现的HEV血清型快速筛查手段得以发展。

3.1 病毒分离与鉴定

病毒分离与鉴定的标本来自于受到攻击的靶器官/组织和相关体液。不同血清型的HEV其结合细胞的受体有所不同，故使用多种细胞用于病毒分离可提高病毒培养的灵敏度、增强病毒感染滴度。常用的HEV分离的敏感细胞有Vero、Hep-2、HeLa、RD等。虽然该技术也存在缺陷(对柯萨奇病毒A组的病毒很难分离，没有统一的标准化细胞培养技术，耗时，耗人力，不能满足高通量和快速筛查的需要)，但到目前为止，细胞培养和依赖于细胞培养的中和试验法仍是病毒分离、毒株传代和血清型鉴定的“金标准”[3,5]。近年来，研究者[15]研发了混合细胞系，目的在于通过应用多种细胞混合培养，节省人力，节约标本量；并在同一反应体系中为病原体培养提供多种细胞系，提高病毒的分离成功率。

3.2 血清学试验

血清学试验并不是目前散发HEV感染病例病原诊断的常用方法之一。一般需取发病早期和恢复期双份血清进行中和试验，若血清特异性抗体有4倍及以上增加，则有诊断意义，然而临床上获取双份血清存在操作上的局限性。大多数情况下，检测患者血清特异性IgM抗体可提供目前正在感染的依据，但要考虑到健康人群中抗体高低对IgM检测结果的影响[5]。2008年手足口病作为丙类传染病被列入《中华人民共和国传染病防治法》，HEV71型IgM抗体检测试剂作为疾病早期诊断试剂，其研发工作得到进一步推动，中国国家疾病预防控制中心参与了试剂质量的评估[16]。结果显示，12%的患者在发病第1天便可检测到特异性IgM抗体，95%以上的患者在4 d后的血清中检测到HEV71型IgM抗体，HEV71型感染与其他HEV感染的交叉反应率约为11.4%。研究者认为，HEV71型IgM血清学诊断可为其感染的早期诊断提供帮助。国外也有报道[17,18]在处理HEV引起的暴发事件中，HEV特异性IgM抗体检测不失为一种快速筛查的手段。

3.3 分子分型技术

HEV基因组为单股正链RNA，长7.2～8.5 kb，两端为保守的非编码区，同源性非常高，中间为连续开放读码框架。此外，5′端有以共价结合的约23个氨基酸组成的病毒基因组连接蛋白(viral genome-linked protein，Vpg)，3′端带有多聚腺苷酸(poly A)尾[19]。病毒RNA编码4个病毒结构蛋白(VP1～VP4)和7个非结构蛋白。VP1、VP2和VP3均暴露在病毒衣壳的表面，VP4位于衣壳内部。VP1区域存在HEV中和抗原决定簇位点[20]，这正是分子分型技术鉴定不同型别HEV的基础。衣壳蛋白VP1区域具有与HEV血清型完全对应的遗传多样性，VP1区域不仅可作为HEV属内不同血清型分类的依据，还可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考。Chu等[21-23]则通过实验证明VP4的核甘酸序列相对保守，变异幅度仅为17.5%～24.4%，因此VP4区域也可用于分子流行病学和基因分型的研究靶片段。马来西亚、日本、澳大利亚多国研究者[24,25]对VP1、VP2和VP4区域HEV分子分型的符合率进行比较，HEV-A组病毒分型结果的符合率为100%。虽然VP2、VP4区域分别与VP1区域病毒分型结果高度符合，但VP2、VP4区域分型结果不能涵盖HEV-B和HEV-C组的所有病毒。

20世纪90年代末，Oberste等[23]设计引物扩增HEV VP1部分序列，将获得的核甘酸序列与GenBank中的标准毒株序列进行对比，以此来判断HEV血清型别。自此，分子分型技术的研发和应用促使HEV研究领域实现第2次飞跃。越来越多的研究者对HEV VP1区域扩增引物进行改良和修饰[5]。到目前为止，对传统法可鉴定的血清型，分子分型技术同样可鉴定出来，且获得更多的基因型别，这为HEV的变异研究拓展了方向。近年来，美国疾病预防控制中心已用分子分型技术替代了传统的中和试验法，从而对HEV血清型进行快速筛查和鉴定。

4 HEV感染引起的疾病

HEV侵入呼吸道、咽喉和肠道，先在局部黏膜和咽、扁桃体等淋巴组织和肠道集合淋巴结中初步增殖，然后释放入血，形成第1次病毒血症，随后扩散至带有受体的靶器官，再次增殖，引起第2次病毒血症和临床症状。大多数HEV感染引发的是温和的自限性疾病，少数可引起重症甚至死亡。不同种类和型别的HEV受体不完全相同，因此一种血清型的HEV可引发多种疾病，一种疾病可由多种血清型的HEV引起[26]。多数HEV的受体在组织和细胞中广泛分布，包括神经系统、呼吸系统、心脏、皮肤/黏膜、肌肉、胰腺、肾上腺等靶器官，引起脑(膜)炎、支气管炎、心肌炎、手足口病、弛缓性麻痹、糖尿病等疾病(表2)。全球流行病与传染病资源信息显示，1948年起英国就有HEV暴发，每年全球包括发达国家和发展中国家均有HEV暴发的报道，至今已有228个国家报道了HEV暴发事件。最常见的疾病有手足口病、脑(膜)炎和急性呼吸道感染性疾病。

表2肠道病毒相关疾病

Tab.2Diseasesassociatedwithhumanenteroviruses

Clinical syndromes PoliovirusCoxsackievirus A Coxsackievirus B EchovirusParalytic diseases++++Aseptic meningitis++++Myocarditis++++Neonatal enterovirus diseases--++Epidemic pleurodynia--++Herpangina-+--Epidemic conjunctivitis-+--Acute respiratory diseases++++Fever of unknown origin++++Type 1 diabetes mellitus--+-

4.1 手足口病

手足口病中主要病原体为HEV71型和柯萨奇病毒A16型，少数病例由柯萨奇病毒A4、A5、A7、A9、A10、B5、B6型引起[27-32]。多见于5岁以下儿童。病毒侵犯口腔黏膜或皮肤上皮细胞，导致口腔溃疡性损伤和皮肤斑丘疹。早期表现为发热、乏力，可出现喷嚏、咳嗽、流涕等感冒样症状，也可出现食欲减退、恶心、呕吐、腹痛等胃肠道症状。其特征性表现为痛性口腔溃疡和无痛性皮肤斑丘疹。口腔溃疡一般在5～7 d内缓解，皮肤斑丘疹一般在5～10 d内结硬皮并逐渐消失。绝大多数手足口病患者预后良好，病死率低于1%。有中枢神经系统、心脏和肺脏并发症的重型患者是手足口病死亡的高危人群。中国自1981年上海报道手足口病以来，各省每年均有散发和暴发病例。2008年安徽阜阳暴发手足口病后，因病死率高而引起广泛重视，卫生部将手足口病列入法定丙类传染病进行监管。近几年来，除HEV71型和柯萨奇病毒A16型仍是手足口病散发、聚集和暴发的最常见病原体外，在法国[33]、美国[34]及我国部分地区均出现了由柯萨奇病毒A6型、A10型感染引起的暴发事件。但手足口病的主要流行地区还是在东南亚，在越南、中国台湾和中国内地流行的HEV71型病毒株的基因型以C4亚型为主[35]。

4.2 病毒性脑(膜)炎

全球流行病与传染病资源信息显示，HEV性脑膜脑炎以埃可病毒和柯萨奇病毒引起的为主，占非脊髓灰质炎型HEV性脑膜脑炎的90%以上。约半数病毒性脑膜炎或脑膜脑炎暴发由埃可病毒30型引起。美国不同地区文献资料显示[36-39]，HEV感染引发的脑(膜)炎占无菌性脑(膜)炎的5%左右。印度研究者[40]汇总了2009～2010年的资料，显示HEV引发的脑(膜)炎病例占全部脑(膜)炎病例的25%。北京[41]1996年的一项调查中显示，儿童急性脑(膜)炎中15.5%是由HEV引起的。在甘肃省[42]用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测病毒性脑(膜)炎标本中HEV IgM，阳性率为8.75%。在上海对诊断疑似乙型脑炎的2004、2005和2010年患者的脑脊液标本进行HEV核酸检测，阳性率为30%左右。由于目前各地区对HEV引起的脑(膜)炎检测的标本种类和采样年龄不同，所以检测结果差距较大。2007年起，我国的云南、山东，以及西班牙和印度都报道了新型HEV75型感染导致的病毒性脑(膜)炎病例[43-45]，因此HEV引起的病毒性脑(膜)炎越来越受重视。

HEV感染引起的脑(膜)炎多见于儿童，主要临床表现为发热、头痛和脑膜刺激等症状，多数呈轻型，在1周内完全恢复，通常无明显不良后果；但脑膜脑炎可留中枢神经系统后遗症。2008年手足口病进行网络直报以后，脑膜刺激症状为判断手足口病重症的标准之一。

4.3 呼吸系统疾病

许多国家如美国、德国、韩国、日本等将HEV视作普通感冒或流行性感冒样病例的重要病原体。2008～2010年，亚洲、欧洲和美国相继报道新型HEV68型导致的支气管炎和肺炎[46]。北京首都儿科研究所2007年[47]报道，在402份标本中检出70份HEV阳性，阳性率为17.4%；下呼吸道感染HEV阳性率为17.7%，上呼吸道感染HEV阳性率为15.9%。近几年来，也出现了HEV109型引起的儿童急性呼吸道感染的报道[48,49]，阳性检出率分别为1.1%和1.6%。

5 展望

HEV分布广泛、种类繁多，引起的疾病呈多样性。虽然5岁以下儿童更易受到HEV的侵犯，但全年龄组人群都会受到不同种类HEV的感染而引发相应疾病。随着科学技术的发展，变异及重组HEV对人类健康的威胁正被不断报道。近3年来，全球范围内包括美国、墨西哥、英国、中国、新加坡、印度等均有手足口病暴发的报道，常见的病原体除HEV71型和柯萨奇病毒A16型外，柯萨奇病毒A6型和A10型引起的手足口病暴发日渐增多。自2010年起，全球范围内由HEV68型引起的感染也时有发生，通常引起呼吸道感染。近5年的国内外文献资料显示，非脊髓灰质炎型HEV性脑膜脑炎占病毒性脑膜脑炎的35%～80%。

鉴于HEV的型别多、所致疾病多样化，今后如能加强临床与基础结合的病因学研究，将有可能发现新的HEV型别及疾病。为提高全民意识、提升临床医师的认知及减轻HEV感染导致的隐性疾病负担，加强对HEV的监测和筛查不容忽视。此外，根据HEV的共有特点，研发共有的疫苗与药物也是值得重视的切入点。

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