牛蒡子苷元对高糖刺激大鼠系膜细胞转化生长因子β1表达的影响*

赵 辉 袁 莉 贾 莉 王卫华 李 琳

(菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最严重的微血管并发症和致死原因。研究表明，转化生长因子β1(transforming growth factor-beta1, TGF-β1)在DN以及肾小球硬化症的发展过程中发挥重要作用[1]。在DN的发病过程中，TGF-β1可引起肾小球系膜基质增厚以及肾小球基底膜增厚，是导致DM患者肾小球硬化的主要因素[2]。近年来研究表明牛蒡子具有降血糖活性，牛蒡子主要成分为牛蒡子苷(ARC)、牛蒡子苷元(ARC-G)等，其中起降血糖作用的主要活性成分为ARC-G[3-4]。前期研究显示ARC-G可以减轻糖尿病大鼠肾损害，而对肾脏系膜细胞(GMCs)的影响却没有报道。本研究初步观察ARC-G对高糖刺激GMCs TGF-β1表达的影响，为更好的开发利用牛蒡子的药用价值提供理论与实验依据。

1 材料和方法

1.1材料 GMCs，武汉大学中国典型细胞培养物保藏中心；RPMI 1640，GIBCO公司； RNA提取、逆转录及PCR试剂盒，上海生物工程有限公司；引物，上海博尚。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将GMCs接种于RPM I-1640培养液中(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U /ml链霉素)，于37℃，5%CO2培养箱中培养。2～3 d传代后，取生长对数期细胞用于实验。

1.2.2GMCs中TGF-β1 mRNA表达检测 取对数生长期GMCs，消化后按1×106/ml/孔接种于6孔板，分为：正常对照组(10%FCS, 含葡萄糖5.4 mmol/L)、高糖组(10%FCS, 含葡萄糖30.0 mmol/L)、ARC-G组(3 μmol/L 、30 μmol/L)，用药组均用高糖培养基培养。各组细胞干预48 h后，收集细胞，按照试剂盒提取细胞总RNA，并测定总RNA含量。按逆转录反应体系10 μl中加RNA 0.5 μg计算，取RNA 0.5 μg逆转录成cDNA。以cDNA为模板，GAPDH为内参，用实时定量PCR的方法进行PCR扩增。TGF-β1：上游引物5’-GCCTGTGTGGCTGTCTTTTGA-3’，下游引物5’-GAAGCGAAAGCCTTGTATTCC-3’，产物243 bp；GAPDH：上游引物5’-TCCTAGCACCATGAAGATG-3’，下游引物5’-AAACGCAGCTCAGTAACAC -3’，产物180 bp。采用实时荧光定量PCR定量分析方法处理各组目的基因mRNA的相对表达量。△△Ct= [Ct(实验组基因)- CtGAPDH(实验组基因)]- [Ct(对照组基因)- CtGAPDH(对照组基因)]。

2 结 果

结果见表1。与对照组比较，高糖刺激后，GMCs TGF-β1 mRNA的表达增加(P<0.05)，经ARC-G作用后，TGF-β1 mRNA的表达下降(P<0.05)，且呈现一定的剂量依赖性。

表1 各组GMCs TGF-β1 mRNA水平比较

组别浓度(μmol/L)TGF-β1正常组-1.00±0.00高糖组-1.33±0.07*ARC-G组31.01±0.08300.90±0.04#

注：与对照组比较，*P<0.05；与HG组比较，#P< 0.05。

3 讨 论

DN是DM最严重的微血管并发症和致死原因。它主要以蛋白尿及进行性肾功能不全为临床特点。DN发病机制极为复杂，早期表现为肾小球内高血压、高灌注、高滤过，进而出现肾小球毛细血管基底膜增厚和系膜基质增多，最终发展为肾小球硬化[5]。GMCs是肾小球中功能最活跃的细胞，具有许多功能，在肾小球疾病的发生发展中处于重要地位。正常情况下，GMCs不增殖，但在多种因素作用下，GMCs可发生异常增殖，同时伴有系膜基质增多，最终发展为肾小球硬化[6-7]。

在DN发病过程中， TGF-β1等细胞因子起着非常重要的作用。TGF-β1属于TGF-β超家族，是由两条二硫键组成的二聚体，是一种由许多细胞分泌的具有许多生物学活性的多肽生长因子，广泛存在于各种正常或病变组织中，参与细胞的增殖、分化和凋亡等过程[8]。TGF-β1在肾脏表达广泛，是最主要的促纤维化生长因子。TGF-β1以旁分泌和自分泌的方式刺激成纤维细胞、肾小管上皮细胞、GMCs等肾脏固有细胞活化增殖，分泌大量Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白(FN)、层粘蛋白(LN)等细胞外基质(ECM)成分，以及基质蛋白降解酶的抑制物。TGF-β1既可以促进ECM成分沉积，又可以抑制其降解。因此，TGF-β1已被公认为导致ECM积聚的重要生长因子，与肾小球硬化密切相关[9]。

牛蒡子是从菊科(Compositae)两年生草本植物牛蒡属牛蒡(Arctium lappa L.)的干燥成熟果实牛蒡子中提取分离而来的木脂素化合物，牛蒡叶中也有少量存在。牛蒡子苷元(arctigenin，ARC-G)为牛蒡子分解后的产物，此外尚有牛蒡子酚A、B、C、D、E、F、H、罗汉松酯素以及数十种2，3-二苄基丁内酯木脂素等[10]。现代药理学证明牛蒡子具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎及免疫调节、降血糖等多重功效。本研究显示，高糖刺激后，GMCs TGF-β1 mRNA的表达增加；经ARC-G干预后，TGF-β1 mRNA的表达下降。其中的机制可能为ARG通过抑制TGF-β1的表达，发挥其肾脏保护作用。

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