外周血单个核的细胞中糖皮质激素受体亚型与突发性聋预后的相关性△

戴艳红 陆玲 吴骎 袁文杰 张秀玲 佘万东

糖皮质激素(glucocorticoid,GC)是治疗突发性聋(sudden sensorineural hearing loss,SSNHL)公认有效的药物之一，它通过与胞浆中糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)结合，调节基因的表达，发挥药理作用。人类GR的主要生理存在形式是 GRα和GRβ，GRα可与GC结合，发挥抗炎、抑制免疫等生物学作用，GRβ不能与GC结合，被认为是GRα的内源性抑制因子，故GRβ增多可能是影响GC作用的重要因素[1]，进而影响GC治疗SSNHL的疗效。富含丝氨酸/精氨酸蛋白家族(serine/arginine-rich proteins,SR蛋白家族)成员SRp30c广泛分布于全身各器官，在促进正常人中性粒细胞的GR pre-mRNA发生选择性剪接形成编码GRβ mRNA的过程中，使GRβ mRNA表达量增加[1]。为了探讨GRα mRNA、GRβ mRNA和SRp30c mRNA的表达量与听力预后的相关性，本研究应用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,QRT-PCR)定量检测了27例SSNHL患者应用GC治疗以后外周血单个核的细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中的GRα mRNA、GRβ mRNA和SRp30c mRNA的表达量，并随访3～4个月，了解患者最终听力恢复情况，现报告如下。

1 资料与方法

1.1研究对象 27例符合诊断标准[2]的SSNHL患者作为研究对象(突聋组)，其中男11例，女16例，年龄25～62岁，平均44.78±10.60岁。均为单耳发病，经过纯音测听、声导抗、听性脑干反应、耳声发射、颞骨薄层CT或MRI检查，排除了中耳、蜗后病变或有明确病因引起的感音神经性听力损失，无家族性耳聋病史。听力正常无耳部疾病的鼻中隔偏曲志愿者6例为对照组，男4例，女2例，年龄20～49岁，平均34.50±9.71岁。

1.2治疗方法 本项目获得南大医学院附属鼓楼医院伦理委员会的批准。突聋组根据患者意愿，给予中耳置管灌注甲泼尼龙[3，4]20例，静脉注射甲泼尼龙治疗7例，另外所有患者均全身应用银杏提取物、甲钴铵、维生素B1等药物治疗。

1.3疗效评定标准 突聋组于治疗前和治疗后3～4个月时分别行纯音听阈检查。参照中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学会SSNHL疗效评定标准(2005年)[2]，以治疗前后受损频率平均纯音听阈(pure-tone threshold average,PTA)改善值作为疗效评估的依据，PTA改善<15 dB为无效，15～30 dB为有效，>30 dB为显效，受损频率恢复至正常、发病前水平或对侧耳水平为痊愈。

1.4QRT-PCR法检测PBMCs中GRα mRNA、GRβ mRNA和SRp30c mRNA方法 突聋组患者中鼓室灌注GC前、治疗后10天两次抽取外周静脉血15例，仅灌注GC前抽血5例；静脉灌注GC治疗者治疗前、治疗后10天分别抽血3例，仅在治疗前抽血4例。对照组和突聋组患者均于早晨6:30抽取外周血20 ml，放入含有EDTA抗凝的试管中，密度梯度离心法分离外周血单个核的细胞(PBMCs)；取提取的PBMCs，按照Trizol法提取总RNA，紫外分光光度计测定其浓度和纯度。根据Prime Script R-T reagent Kit试剂盒说明书，进行逆转录反应，反应总体系10 ul，反应条件37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 sec，cDNA产物置-20℃保存。

QRT-PCR法检测目的基因，引物由Pri-mer5.0软件自行设计。引物序列：GRα mRNA：上游5'-GAAGGAAACTCCAGCCAGAAC-3',下游5'-CTGATTGGTGATGATTTCAGCTA-3'；GRβ mRNA：上游5'- GAAGGAAACTCCAGCCAGAAC-3',下游5'- TGACTTATTATTGACAACGAAGTGC-3'；SRp30c mRNA：上游5'- TGTTTCAGGACTTCCTCCGTCAG-3',下游5'- AGGGCATATTCCATGTCTTCTTT-3'； β-actin mRNA：上游5'- TGGCACCCAGCACAATGAA-3',下游5'- CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。

PCR循环参数为95 ℃预变性30 sec，95 ℃变性5 sec，62 ℃退火/延伸20 sec，循环40次。扩增反应结束后，立即进行融解曲线分析，判定是否有非特异性扩增产物的存在。分别计算 GRα mRNA、GRβ mRNA、SRp30c mRNA 及β-actin mRNA的Ct值,两者之差即为△Ct值，2-△Ct作为评价目的基因相对表达水平的指标。

1.5统计学方法 用SPSS18.0统计软件分析。本组资料不符合正态分布，正文采用Mann-Whitney秩和检验、Wilcoxon带符号秩检验和Spearman相关系数检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1突聋组听力观察结果 治疗后随访3～4个月，突聋组27例患者中有效11例，显效2例，痊愈2例，无效12例。将有效、显效和痊愈者共15例纳入有效组，无效者12例纳入无效组进行GRα mRNA、GRβ mRNA、SRp30c mRNA表达量分析比较。

2.2有效组、显效组、对照组GRα mRNA与GRβ mRNA表达量的比较 27例SSNHL患者中，有效组15例，10例在治疗前后各抽血1次，5例仅治疗前抽血1次(n=25)；无效组12例，8例治疗前后各抽血1次，4例仅治疗前抽血1次(n=20)。对照组6例，均取术前血样本一次(n=6)。三组GRα mRNA表达水平均显著高于GRβ mRNA(表1)，差异有统计学意义。

表1 各组GRα mRNA与GRβ mRNA表达量2-△Ct的比较

注：表中扩号前数据为中位数，扩号内为四分位数；下表同

2.3各组GRβ mRNA与SRp30c mRNA表达量的相关性检验 本组共51份血标本GRβ mRNA与SRp30c mRNA的表达量存在显著正相关性(r=0.492，P=0.000)。

2.4有效组、无效组与对照组治疗前GRα mRNA、GRβ mRNA和SRp30c mRNA表达量的比较 有效组、无效组、对照组治疗前GRα mRNA、GRβ mRNA、SRp30c mRNA表达量以及GRα mRNA/GRβ mRNA比值见表2，三组间比较差异均无统计学意义。

表2 有效组、无效组与对照组治疗前GRα mRNA、GRβ mRNA和SRp30c mRNA表达量及GRα mRNA/GRβ mRNA比值比较

2.5治疗前鼓室灌注GC的有效者与无效者，静脉滴注GC治疗的有效者和无效者GRα mRNA、GRβ mRNA、SRp30c mRNA表达量以及GRα mRNA/ GRβ mRNA比值比较 鼓室灌注GC治疗的20例中，有效12例，无效8例，治疗前有效者和无效者PBMCs中的GRα mRNA、GRβ mRNA、SRp30c mRNA表达量以及GRα mRNA/ GRβ mRNA比值比较，差异无统计学意义(表3)。静脉滴注GC治疗的7例中，有效3例， 无效4例，治疗前有效者与无效者PMMCs中上述各项指标比较差异同样均无统计学意义(P>0.05)。

表3 鼓室灌注GC治疗有效与无效者治疗前GRα mRNA、GRβ mRNA和SRp30c mRNA表达量及GRα mRNA/ GRβ mRNA比值比较

2.6鼓室灌注GC有效者治疗前后GRα mRNA、GRβ mRNA及GRα/GRβ比值比较 鼓室灌注GC治疗有效的12例中灌注前、后均抽血8例，这8例灌注后GRα mRNA和GRβ mRNA表达量下调，与灌注前相比差异有统计学意义(表4)，GRα mRNA/GRβ mRNA比值灌注后与灌注前相比也下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 鼓室灌注GC治疗有效者治疗前后GRα mRNA、GRβ mRNA及GRα/GRβ比值比较(n=8)

2.7鼓室灌注GC无效者治疗前后GRα mRNA、GRβ mRNA及GRα/GRβ比值比较 鼓室灌注GC治疗无效的8例中灌注前、后均抽血7例，该例灌注前GRα mRNA、GRβ mRNA表达和GRα mRNA/ GRβ mRNA比值与灌注后比较，差异无统计学意义(表5)。

表5 鼓室灌注GC治疗无效者治疗前后GRα mRNA、GRβ mRNA及GRα/GRβ比值比较(n=7)

3 讨论

SSNHL发病机制目前尚不十分清楚，一般认为与病毒感染、血管因素、自身免疫或代谢紊乱等不同病因有关，GC可抑制上述各种病因引起的内耳炎症反应、改善微循环、维持内外淋巴液的离子平衡[5,6]，在SSNHL的治疗中被国内外同行广泛接受和认可[7]，被推荐为主要治疗手段[5,8]。

在细胞水平GC通过与胞浆中的GR结合，激活的受体转移至细胞核内调节基因的表达，从而在靶器官发挥生物学效应。人类GR基因经选择性剪接可生成五种亚型：GRα、GRβ、GRγ、GRp(即GRδ)及GRA[9]，其中GRα和GRβ是主要生理存在形式。这两种GR蛋白N末端的前727位氨基酸相同，此区域包括DNA结合区和转录结合区；而C末端序列有所不同，这种不同导致GRα可与GC结合，而GRβ因无激素结合区不与GC结合；两者均可与GC反应元件(glucocorticoid responsive element,GRE)结合，但GRβ不能直接激活靶基因[10]。GR亚型依靠激素依赖模式通过模式转换向靶组织传递激素信息，GRα是介导GC效应的主要受体亚型，当两种受体亚型存在于同一细胞时，GRβ抑制激素依赖性的GR诱导的基因表达，因此GRβ很可能是一种内源性GR抑制剂。有报道认为[11]，在某些病理状态下GRβ表达增加，在细胞中对GC反应性起关键作用的是GRα/GRβ比值，高比例与GC敏感有关，而低比例与GC抵抗的发生有关。故本研究通过检测SSNHL患者PBMCs中的GRα mRNA、GRβ mRNA含量，计算GRα mRNA/ GRβ mRNA比值，随访SSNHL患者的听力预后，分析GR亚型与GC治疗SSNHL的敏感性及与听力预后是否存在相关性。

正常情况下人体大多数细胞中GRα占主导地位，GRβ mRNA水平远低于GRα mRNA，仅占总GR mRNA的0.12%～0.13%[1]，本组GC治疗有效组、无效组和对照组中的GRα mRNA表达量均显著高于GRβ mRNA，GRα mRAN占主导地位，且GRβ mRNA的表达量与SRp30c mRNA存在正相关，验证了SRp30c可促进GR pre-mRNA发生选择性剪接形成GRβ mRNA[1]。

全身给药和鼓室灌注给药后的GC需分别经血迷路屏障和圆窗膜渗透进入内耳，与内耳组织细胞中的GR受体结合方能发挥抗炎、抑制免疫等生物学作用。然而，目前无法直接观察SSNHL患者活体耳蜗组织细胞中的GR亚型。动物实验研究发现[12]：GR mRNA与GR蛋白在豚鼠PBMCs和耳蜗组织中均有表达，且PBMCs中的GR mRNA、GR蛋白表达量与耳蜗组织中的表达量存在正相关。Kassner等[13]观察了12例SSNHL患者外周血中的肿瘤坏死因子(tumor neorosis factor,TNF)、可溶性CD40(sCD40)以及特定表型的淋巴细胞，并与年龄匹配的健康对照组进行比较，发现SSNH患者的促炎转录因子和炎症介质均较对照组明显增高，表明外周循环中的炎性介质和淋巴细胞能够反映SSNHL患者内耳的炎症状态。通过检测外周循环中的炎症因子、氧化应激标记物以及PBMCs表达的促炎、促凋亡或促粘附因子等来研究SSNHL内耳的发病机制是可行的[13,14]。

本研究采用QRT-PCR法检测SSNHL患者PBMCs中GRα mRNA、GRβ mRNA、SRp30c mRNA表达量，并计算GRα/GRβ比值，结果显示，治疗前上述指标在有效组、无效组和对照组间均无统计学差异，即本组资料尚不能支持PBMCs中 GR亚型与SSNHL患者GC治疗是否有效及听力预后存在相关性，与李春林等[15]的研究结果不完全一致，他们采用RT-PCR的方法检测SSNHL患者PBMCs中的GRα mRNA、GRβ mRNA，同时给予口服醋酸泼尼松片及银杏叶提取物注射液治疗，结果GRβ mRNA在治疗无效组明显高于治疗有效组和对照组，GRα/GRβ比值无效组明显低于有效组和对照组。分析原因可能为：首先，GRβ亚型绝对数量或比值增高仅是GC抵抗(治疗无效)的众多分子机制之一，其他机制如遗传因素所致的家族性GC抵抗、GR的磷酸化或硝基化修饰、促炎转录因子(如NF-κB、AP-1)增加、组蛋白乙酰化异常等因素[16,17]可能更为重要，这些机制可能同时作用或某个机制起主要作用，相关的研究需要进一步深入；其次，本组样本量偏少，不能根据SSNHL患者的听阈曲线类型、听力损失程度以及发病后开始治疗的时间长短进行分组分析，也不能排除上述与SSNHL预后有关的其他因素的影响，重点观察GR亚型与GC敏感性和听力预后的相关性。

有文献报道短期全身应用大剂量地塞米松可使PBMCs与耳蜗组织中的GR mRNA、GR蛋白含量同步上调，长期使用GC则可导致GR的下调[18]；前期动物实验结果[12]也观察到，豚鼠短期全身应用大剂量地塞米松可使PBMCs与耳蜗组织中的GR mRNA、GR蛋白含量同步上调。本研究分别比较了SSNHL患者鼓室灌注GC治疗有效和无效者在灌注GC前后PBMCs中的GRα mRNA、GRβ mRNA表达和GRα mRNA/GRβ mRNA比值，结果在灌注GC治疗有效者中，灌注后GRα mRNA和GRβ mRNA表达与灌注前相比下降，差异有统计学意义；而在灌注GC治疗无效者中，灌注前后两者的表达量差异无统计学意义。分析鼓室灌注GC治疗有效的病例，GC能够有效地经圆窗膜渗透进入内耳，抑制内耳的炎症反应，内耳炎症状态减轻，内耳组织中的GRα mRNA和GRβ mRNA表达下调，进一步在外周循环的PBMCs中反映出来。

总之，SSNHL患者GC抵抗的机制可能是多方面的，本研究结果提示仅从治疗前的单次GR亚型检测尚不能预测SSNHL患者的GC治疗效果，但治疗后GRα mRNA和GRβ mRNA表达下调，可能提示良好的听力预后，但还需积累病例、增加样本量继续研究。

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