99Tcm-膜连蛋白V在下腔静脉血栓模型家兔体内生物分布

吴大勇，张文艳，边艳珠，胡玉敬

(河北省人民医院 核医学科，河北 石家庄 050051)

深静脉血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)是导致肺动脉血栓栓塞(pulmonary thromboembolism，PTE)的主要原因，51%～71%下肢 DVT 患者可能发生PTE[1]。DVT的影像诊断主要依靠超声检查，而超声检查不能分辨新鲜与陈旧静脉血栓，因此存在明显的不足[2]。

急性新鲜血栓中血小板活化后膜表面暴露带负电荷磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)，膜连蛋白 V(Annexin V)依赖钙离子能够特异的与PS结合，具有纳摩尔级的亲和力[3]。

PTE误诊率、病死率高，西方国家DVT和PTE的年发病率分别为 0.1%和 0.05%[4]。急性静脉血栓主要为新鲜混合血栓，其中混合血栓内的白色血栓部分富含活化血小板，而形成时间较长的静脉陈旧混合血栓，多发生机化血栓活化血小板明显减少[5]。新鲜静脉血栓较陈旧机化血栓脱落风险更大，二者的鉴别对制定临床治疗计划具有关键意义[6]。

根据与活化血小板结合的靶位点不同，血栓活化血小板显像剂主要分为与GPIIbIIIa受体结合、与P-选择素结合、与PS结合三类[7]。与GPIIbIIIa受体结合的显像剂研究较多[8-11]，99Tcm-P280已被美国FDA批准应用于临床急性下肢血栓显像。但多肽制备成本高，价格昂贵，其应用受到一定限制。季顺东[12]、吴锦昌[13]、方纬[14]等利用99Tcm标记国内自行研制的P-选择素单克隆抗体SZ-51成功对新鲜动脉、下肢深静脉及肺动脉血栓显像，但单克隆抗体相对分子质量较大，血液清除较慢，显像中本底较高，图像质量亦受到一定影响。

与PS结合的显像剂主要为放射性核素标记Annexin V，已有关于99Tcm-Annexin V对急性左房血栓[15]、腹主动脉瘤附壁血栓[16]、感染性心内膜炎血栓性赘生物[17]、新鲜动脉血栓[18-20]显像研究的报道。Rouzet F等[17]实验中观察到在制备感染性心内膜炎动物模型过程中，因导管损伤上腔静脉内壁形成的静脉血栓摄取99Tcm-Annexin V以及肺内栓子摄取99Tcm-Annexin V，这也为99Tcm-Annexin V静脉血栓显像及肺动脉栓塞血栓显像提供了依据。

本实验拟研究99Tcm-Annexin V在下腔静脉血栓模型家兔的体内分布，并对新鲜与陈旧静脉血栓对99Tcm-Annexin V的摄取情况进行分析。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

ZD-6000井型γ计数锝分析仪：西安志达公司产品；钼锝发生器：北京原子高科股分有限公司产品；Annexin V(Bender Medsystems公司)、氯化亚锡：分析纯，天津市化学试剂三厂产品；新华1号滤纸：北京师范大学化学院惠赠；丙酮：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司产品；柠檬酸、柠檬酸钠：分析纯，天津市博迪化工股份有限公司产品；葡萄糖：分析纯，天津市百世化工有限公司产品；酒石酸钾钠：分析纯，天津市永大化学试剂有限公司产品。

1.2 实验动物

新西兰家兔：15只，雌雄不拘，体重2.0～2.5 kg，购自河北医科大学实验动物中心，合格证编号为1009032。

2 实验方法

2.1 99Tcm-Annexin V制备

取柠檬酸0.48 g、柠檬酸钠1.32 g、葡萄糖1.47 g，置于烧杯中加100 mL蒸馏水，搅拌至充分溶解，制备柠檬酸葡萄糖溶液(ACD)待用。参照文献[21]取一洁净反应瓶，加入Annexin V 30 μg、ACD溶液500 μL、酒石酸钾钠溶液(10 g/L)100 μL、SnCl2/HCl溶液(2 g/L)10 μL，摇匀，充分反应，2～4 ℃冰箱冷藏20 min，加入高锝酸钠溶液1 mL(1 110 GBq/L)，室温下反应20 min，完成标记。利用新华1号滤纸为固定相、丙酮做展开剂，测定99Tcm-Annexin V 的Rf，测定99Tcm-Annexin V标记率，室温下及37 ℃恒温箱保存1、2、3、4、5及8 h的放化纯度。

2.2 下腔静脉血栓模型家兔的建立

3%戊巴比妥钠1～1.3 mL/kg耳缘静脉注射麻醉后固定于手术台，右侧腹备皮，沿腹直肌右外侧线切开皮肤4～6 cm切口，逐层钝性分离腹壁肌肉、腹膜，入腹腔后钝性分离后腹膜，暴露右肾下极水平以远约4 cm长下腔静脉，将长约3 cm自制单股螺旋铜丝向心方向穿刺入下腔静脉留置，缝合血管，止血，观察下腔静脉回流通畅后回纳肠管，逐层缝合腹膜、肌肉、皮肤。家兔术后清洁环境饲养。

2.3 99Tcm-Annexin V的家兔体内分布

将15只实验兔随机分为新鲜血栓组、陈旧血栓组及对照组，每组5只。前两组建立下腔静脉血栓模型，对照组与血栓组进行相同的手术过程，但未在下腔静脉内置入螺旋铜丝。新鲜血栓组与对照组于术后1 d进行体内分布实验，陈旧血栓组于术后14 d进行体内分布实验。

各组实验兔均经耳缘静脉注射99Tcm-Annexin V 4 mCi，于注射99Tcm-Annexin V 1 h后均经耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠处死，分离组织、血栓，计算放射性摄取率。新鲜血栓组和陈旧血栓组分别取血栓、血液、血栓部位下腔静脉血管、头侧下腔静脉血管、后肢肌肉、胃、心、肺、肝、肾、脾、骨及小肠组织；对照组取对应组织。将上述所取组织生理盐水冲洗干净，纱布粘干，测所取各组织及血液放射性计数并准确称重，计算所取标本的放射性摄取率(%ID/g)。计算两血栓组血栓分别与血液、血栓部位下腔静脉血管、头侧下腔静脉血管、肌肉的放射性摄取比(T/NT)。

2.4 病理检查

两血栓组血栓称重及测量放射性计数完毕后，立即置于福尔马林固定液中。将所留存血栓标本进行HE染色确定血栓病理特征。

2.5 统计学分析

3 结果与讨论

3.1 99Tcm-Annexin V标记

测定99Tcm-Annexin V 的Rf为0.1。99Tcm-Annexin V标记率为98%，室温下及标记后37 ℃恒温水浴箱保存4 h内放化纯度均高于95%，8 h放化纯度仍大于90%，标记物体外稳定性良好。

3.2 病理检查

新鲜与陈旧血栓组血栓及病理图示于图1。新鲜血栓组实验兔解剖后下腔静脉内肉眼均可见血栓形成，血栓沿螺旋铜丝红白相间或以白色为主。陈旧血栓组解剖后肉眼亦均可见血栓形成，血栓沿螺旋铜丝红白相间；对照组解剖后下腔静脉内未见血栓形成，下腔静脉回流通畅。新鲜血栓组、陈旧血栓组实验兔血栓重量分别为(0.058±0.013)g和(0.088±0.064)g。

3.3 99Tcm-Annexin V的家兔体内分布

99Tcm-Annexin V在家兔体内分布结果列于表1。新鲜血栓组、陈旧血栓组血栓放射性摄取率分别为(0.018 94±0.002 16)%ID/g、(0.004 73±0.001 28)%ID/g。新鲜血栓组血栓放射性摄取率与陈旧血栓组进行两样本t检验，结果差异有统计学意义(t=12.66，P<0.05)。新鲜血栓组血栓与血液、血栓与血栓部位下腔静脉血管、血栓与头侧下腔静脉血管、血栓与肌肉的T/NT分别为3.42±1.06、26.32±13.60、31.23±16.00、111.62±52.23，高于陈旧血栓组：0.98±0.09、5.12±2.01、6.25±2.38、21.82±5.93，两组数据分别进行两样本t检验，结果差异有统计学意义(t分别为5.14、3.44、3.45、3.82 ，P<0.05)。

新鲜血栓组血栓病理证实均为新鲜混合血栓，镜下见淡红色珊瑚状血小板小梁，小梁间纤维素网内包含红细胞，小梁边缘有较多中性粒细胞粘附(见图1a)；陈旧血栓组血栓病理证实均为陈旧机化混合血栓，镜下见珊瑚状血小板小梁，小梁间隙可见多量内皮细胞分化趋势细胞，小梁间纤维素网内包含少量红细胞及较多附着的中性粒细胞，呈机化表现(见图1c)。新鲜的静脉血栓较陈旧静脉血栓含有更多的活化血小板，99Tcm-Annexin V的体内分布数据反映了这一生理特性。新鲜血栓组血栓与血液的放射性摄取比为3.42±1.06，由数据推测利用99Tcm-Annexin V显像，能够获得较清晰的图像。但三组实验兔血液放射性摄取率相对较高，可能显像本底会相对较高。

a——新鲜血栓组血栓照片，血栓沿螺旋铜丝附着；b——病理(HE染色，放大40倍)，显示为新鲜混合血栓，白色血栓与红色血栓间或存在；c——陈旧血栓照片，血栓沿螺旋铜丝附着；d——病理(HE染色，放大40倍)，显示为陈旧机化混合血栓，血栓小梁间隙可见多量血管内皮细胞分化趋势细胞，呈机化表现。图1 新鲜与陈旧血栓组血栓及病理图Fig.1 The thrombi of the fresh and old thrombus groups and the pathological section by Hematoxylin-eosin stains：

组织各组放射性摄取率/(%ID·g-1)新鲜血栓组陈旧血栓组对照组血栓 0.018 94±0.002 160.004 73±0.001 28血液0.005 81±0.001 170.004 77±0.000 920.005 92±0.002 20血栓部位下腔静脉0.000 78±0.000 330.000 98±0.000 260.001 07±0.000 34头侧下腔静脉0.000 69±0.000 240.000 81±0.000 24肌肉0.000 19±0.000 060.000 22±0.000 050.000 23±0.000 04肝0.012 94±0.006 090.006 88±0.005 940.010 47±0.008 16肾0.977 71±0.367 380.855 81±0.415 470.742 72±0.423 76脾脏0.000 90±0.000 340.001 02±0.000 450.001 08±0.000 54胃0.001 08±0.000 520.001 04±0.000 510.001 00±0.000 69骨0.000 70±0.000 250.001 28±0.001 840.000 72±0.000 39心0.004 15±0.004 770.001 11±0.000 450.001 54±0.001 04肺0.002 39±0.002 150.002 04±0.001 550.002 18±0.002 29小肠0.001 32±0.000 760.001 40±0.000 510.001 56±0.001 10

4 小结

新鲜静脉血栓对99Tcm-Annexin V的摄取明显高于陈旧静脉血栓，且新鲜血栓组血栓与血液的放射性摄取比较高，通过体内分布数据推断，99Tcm-Annexin V有望应用于新鲜静脉血栓显像，以及鉴别新鲜与陈旧静脉血栓。

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