点击化学法制备奥曲肽类似物18F-Ta-Gluc-TOCA及其生物学评价

温 凯，陈宝军，2，郭飞虎，2，梁积新，2，殷 胤，陈大明，崔海平

(1.原子高科股份有限公司，北京 102413;2.中国原子能科学研究院，同位素研究所，北京 102413)

生长抑素是由D细胞分泌的一种环状多肽类激素，是一种具有广泛生理学功能的内源性调节肽，对许多实体肿瘤及正常组织有抗增生作用，还可抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡[1-3]。奥曲肽是一种人工合成的生长抑素，体内作用时间可达2 h，作用较天然的生长抑素单一、持久，易被放射性核素标记。

奥曲肽作为一种重要的生长抑素类似物，与生长抑素受体有良好的亲和力，已经成为一种重要的肿瘤治疗药物，多种放射性核素标记的奥曲肽已经进入临床应用。18F标记奥曲肽类似物在国外已有一系列的合成方法报道，1994年，Guhlke等[4-5]成功完成了(2-18F-Fluoropropionyl-(D)phe1)- octreotide 的合成，该标记方法的优点为：酰化试剂活性高，空间位阻小，副反应少，但其合成时间较长，在肿瘤摄取较低。2003年，Wester等[6-7]合成了18F-FP-Gluc-TOCA，通过引入葡萄糖基明显改善了奥曲肽的亲水性和稳定性，但其合成时间大约需要3 h，放化产率为(25±5)%。2006年，Schirrmacher[8-10]制备了18F-SiFA-TATE，反应机理为同位素交换反应，最终的标记率较高，生物体内分布较好，但其在肝、肾摄取较高，体内稳定性不够理想。2010年，Laverman等[11-12]利用NOTA环螯合Al18F，利用此基团来标记一系列奥曲肽类似物。点击化学(click chemistry)，其实质是指选用易得原料，通过可靠、高效而又具选择性的化学反应来实现碳杂原子连接，低成本、快速合成大量新化合物的一套强大且实用的合成方法[13]。目前，该技术已在众多研究领域得到迅速发展[14]，并已有标记多肽方面研究的报道[15-18]。本实验采用点击化学的方法，在温和条件下和较短时间内完成标记[19-20]，符合PET药物的制备要求。所用的奥曲肽类似物经过修饰，加入葡萄糖基，有利于增加奥曲肽的亲水性，更有利于肿瘤的吸收。

1 主要材料和仪器

1.1 实验材料

乙二醇双对甲苯磺酸(化合物1)：东京化成工业株式会社；叠氮化钠、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、石油醚、硫酸铜、抗坏血酸钠、冰醋酸、氯化钠、乙醇、三氟乙酸、无水硫酸钠、无水硫酸镁、氟化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、碳酸钾：国药集团化学试剂公司；乙腈：北京益利精细化学品有限公司；K2.2.2：北京派特生物技术有限公司；前体化合物Pr-Gluc-TOCA：杭州中肽有限公司协作制备，纯度95.1%。

实验动物采用Balb/C裸鼠，鼠龄为4～6周：北京华阜康生物技术有限公司；采用的癌细胞为AR42J细胞，大鼠胰腺外分泌细胞，癌细胞在含10%小牛血清的RPM1-1640培养基中，于CO2恒湿孵育箱中培养，常规传代：中国医学科学院肿瘤研究所提供。

1.2 实验仪器

Eclipse HP型回旋加速器(11 Mev)：德国西门子公司；高效液相Agilent 1100：美国安捷伦公司；C18色谱柱，φ4.6 mm×250 mm：德国Merck公司；高效液相系统ProStar 320系统：美国Varian公司；C18色谱柱：4.6 mm×250 mm，美国Thermo公司；GABI型高效液相色谱放射性监控仪：Raytest公司；Varian Mercury-Plus 400型核磁共振仪：美国Varian公司；Applied biosystems QTRAP 2000型质谱仪：美国AB公司；CRC-15PET放射性活度计：美国Capintec公司； Sep Pak light C18 柱、Sep Pak light QMA柱：Waters公司；BHC-336定标器、FT-663闪烁探头：北京核仪器厂；MH2800A加热模块：Auto Science公司；水净化系统：法国Millipore公司；KQ5200超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；旋涡混合器：北京北德科学器材有限公司；V-vials瓶，5 mL：美国Wheaton公司。

2 实验方法

2.1 18F-Ta-Gluc-TOCA的合成

2.1.12-叠氮对甲苯磺酸乙酯(化合物2)的制备

取化合物1 1.84 g(10 mmol)溶于16 mL的无水DMF中，分四批加入叠氮化钠0.32 g(10 mmol)，反应混合物在常温下搅拌48 h；然后过滤除去固体残渣，滤液转移至100 mL水中，充分搅拌，使化合物1充分重结晶，用真空泵进行抽滤，得到化合物2的水和DMF混合溶液；再用30 mL乙酸乙酯萃取3次，萃取前加少量NaCl防止乳化，合并有机相后用20 mL饱和食盐水洗涤；有机相用无水硫酸钠和无水硫酸镁混合干燥2.5 h，减压蒸掉溶剂得粗产品约0.650 g，产率约26.9%。再以V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶2.5为流动相，硅胶柱分离。采用核磁、质谱鉴定化合物2结构，通过HPLC来测定其化学纯度，色谱流动相A水(含0.1%三氟乙酸)和流动相B乙腈(含0.1%三氟乙酸)；流速：1.0 mL/min；0 min，100%A；20 min，0%A；30 min，0%A；35 min，100%A。

2.1.22-18F叠氮乙烷(化合物3)的制备

18F-Ta-Gluc-TOCA合成路线示于图1。18F生产条件为：核反应18O(p，n)18F，采用1.5 mL H2O[18O]富氧水靶，在回旋加速器上用质子束流连续轰击15～30 min，流强50 μA，效率80%，得到18F-。取18F-约11.1×107Bq，注入到事先活化好的QMA柱(先用5 mL 10% K2CO3润洗，再用10 mL去离子水清洗，最后用20 mL空气排出柱上水分)上，用0.6 mL K2.2.2/ K2CO3溶液洗脱得到活的18F-KF。将上述18F-KF注入5 mL 的V-vials瓶中，在100 ℃加热模块上加热，通氮气吹干乙腈和水分，再加三次500 μL色谱纯乙腈吹干，保证反应体系无水，取出反应瓶冷却。

图1 18F-Ta-Gluc-TOCA合成路线Fig.1 Synthesis of 18F-Ta-Gluc-TOCA

向活化后含有18F-KF的反应瓶中，分三批加入2-叠氮对甲苯磺酸乙酯(化合物2)(0.125 mg，0.52 μmol)的250 μL无水乙腈的溶液，反应混合物加热到100 ℃，N2下吹干乙腈，再加300 μL无水乙腈复溶，密闭反应15 min后停止反应，冰水浴冷却到室温。

采用高效液相色谱放射性监控仪检测放化纯度。色谱流动相A为水(含0.1%三氟乙酸)和流动相B为乙腈(含0.1%三氟乙酸)；流速：1.0 mL/min；0 min，95%A；3 min，95%A；10 min，10%A；15 min，25%A；20 min，95%A。

2.1.318F-Ta-Gluc-TOCA的制备

在含有2-氟叠氮乙烷(化合物3)的瓶中，氮气保护下，加入100 μL 0.10 mol/L pH 6.0 PBS溶液，加入25 μL 0.45 mol/L硫酸铜溶液和60 μL 3.0 mol/L抗坏血酸钠溶液，再加入250 μL Pr-Gluc-TOCA(化合物4，0.5 mg，0.36 μmol)的 PBS溶液，在室温下反应20 min。用Sep Pak Light C18柱分离纯化。18F-Ta-Gluc-TOCA检测方法同化合物3。

2.2 合成条件的选择

2.2.1化合物2投料量对标记率影响

化合物4用量保持0.5 mg，化合物2的投料量一个当量为0.091 mg，分别取2、1、0.25、0.125、0.091 mg化合物2和9.3×107Bq18F-，保持其他反应条件不变，分析对18F-Ta-Gluc-TOCA标记率的影响。

2.2.2pH 对标记率影响

分别以pH为4、5、6、7、8为反应环境，进行完整的合成实验，保持其他反应条件不变。

2.3 体外稳定性测定

取含18F-Ta-Gluc-TOCA的试剂约5.6×106Bq，置于1 mL 0.10 mol/L,pH 6的PBS中，置于37 ℃下，孵育30、60、90、120 min后，采用HPLC法测定其放化纯度，观察其体外稳定性。

2.4 脂水分配系数测定

取5.5×106Bq18F-Ta-Gluc-TOCA，将其加入到含1 mL正辛醇和1 mL 0.10 mol/L,pH 6的PBS两相溶剂中，密封涡旋，静置使两相恢复平衡。用移液器分别取出两相各500 μL，用γ计数器计数，重复三次，计算脂水分配系数。

2.5 正常小鼠体内生物分布

取正常小鼠16只，随机分成4组，每组4只，分别经尾静脉注射100 μL约5.6×106Bq18F-Ta-Gluc-TOCA的生理盐水溶液，分别于注射后15、30、60、120 min处死，取心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、肌肉、骨头、血等相应器官置于计数管底部，称重并测量计数。经衰变校正后计算各组织的每克组织放射性摄取率(%ID/g)。

2.6 荷瘤裸鼠体内分布实验

取荷AR42J瘤裸鼠8只，分成2组，每组4只，分别经尾静脉注射100 μL约5.6×106Bq18F-Ta-Gluc-TOCA的生理盐水溶液，分别于注射后60、120 min处死，取心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、肌肉、骨头、血、肿瘤等相应器官置于计数管底部，称重并测量计数。经衰变校正后计算每克组织放射性摄取率(%ID/g)。

3 结果与讨论

3.1 18F-Ta-Gluc-TOCA的合成

3.1.1化合物2的合成

2-叠氮对甲苯磺酸乙酯的HPLC图示于图2。化合物2性状为淡黄色油状物，共0.054 g，柱分离效率约8.5%。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：7.82 (d, J = 8.0 Hz, 2H, C2H), 7.37 (d, J = 8.0 Hz, 2H, C3H), 4.16 (t, 2JHH= 5.2 Hz, 2H, SCH2), 3.48 (2JHH= 5.2 Hz, 2H, NCH2), 2.45(s, 3H, CH3); MS: 242.1(M+H), 259.1(M+NH4), 264.1(M+Na)。结果显示，化合物2的结构正确，相对分子质量241.2；保留时间为13.833 min纯度较高，大于97%，可以进行下一步实验。

图2 2-叠氮对甲苯磺酸乙酯的HPLC图 Fig.2 HPLC chromatography of 2-azide-ethyl-p-toluenesulfonate

3.1.2化合物3的合成

2-18F叠氮乙烷的HPLC图示于图3。在反应开始后，化合物3很快就开始生成，化合物2不断减少，直到反应结束，化合物2基本完全反应，化合物3产率大于98%。

图3 2-氟叠氮乙烷的HPLC图Fig.3 HPLC chromatography of synthesizing 2-fluorine aziethane

3.1.318F-Ta-Gluc-TOC的合成

18F-Ta-Gluc-TOCA的HPLC图示于图4。合成18F-Ta-Gluc-TOCA实验主要分为两步，第一步合成化合物3，第二步合成18F-Ta-Gluc-TOC。化合物3的标记率为80%，第二步反应标记率相对较低，总标记率约为57%，需要进行分离纯化。经过对分离纯化条件的优化，最终选定使用Light C18柱进行分离纯化。分离纯化后18F-Ta-Gluc-TOCA放化纯度达到91%，校正后比活度为7.4×107Bq/mg。

图4 18F-Ta-Gluc-TOCA的HPLC分析图 Fig.4 HPLC chromatography of 18F-Ta-Gluc-TOCA

3.2 合成条件选择

3.2.1化合物2投料量

当化合物2投料量为2、1、0.25、0.125、0.091 mg时，18F-Ta-Gluc-TOCA的标记率分别为78%、、80%、75%、78%、40%。当投料量为0.125 mg以上时，标记率基本保持在75%至80%之间，投料量过小，标记率会有明显下降，为了提高标记率，尽量减少化合物2的投料量，因此选择化合物2用量0.125 mg。

3.2.2pH影响

在pH4、5、6、7、8时，18F-Ta-Gluc-TOCA标记率分别为73%、75%、78%、80%、78%，标记率基本稳定。这也证实了点击反应对pH要求低的特点，为了维持多肽的活度，选取pH为6作为反应条件。

3.3 体外稳定性

18F-Ta-Gluc-TOCA体外稳定性结果示于图5。由图5可知，18F-Ta-Gluc-TOCA的体外稳定性较好。但是其稳定性随时间变化略有降低，这可能是由于18F与碳链的连接不稳定，有少量18F离子脱下。

图5 18F-Ta-Gluc-TOCA的体外稳定性Fig.5 Stability of 18F-Ta-Gluc-TOCA in vitro

3.4 脂水分配系数

对18F-Ta-Gluc-TOCA进行亲脂性实验，测得其脂水分配系数为-0.43±0.05。说明18F-Ta-Gluc-TOCA的亲水性得到了一定的提高，但相对18F-FP-Gluc-TOCA仍然较低。由于丙炔酸和2-18F叠氮乙烷增加了碳链长度，也在一定程度上降低了其亲水性。

3.5 正常小鼠体内生物分布

18F-Ta-Gluc-TOCA在正常小鼠体内的生物分布结果列于表1。由表1可以看出，18F-Ta-Gluc-TOCA在正常小鼠体内肝吸收最强，15 min时为11.85%ID·g-1，肾吸收为其次，15 min时为4.12%ID·g-1肝与肾放射性摄取比(T/NT)约为2.9∶1；该药物主要通过肝脏代谢，其次通过肾代谢；在其他器官的摄取均较低，股骨有少量的摄取；各器官的摄取均随着时间不断下降，18F-Ta-Gluc-TOCA的血液清除较快。该药物的肝吸收高主要是由于18F-Ta-Gluc -TOCA的结构中加入了丙炔酸，同时在点击反应后又加入了2-18F-叠氮乙烷，导致其碳链较长，增加了其亲脂性，使其主要通过肝脏代谢；该药物在骨中有摄取主要是因为少量游离的18F-。

3.6 荷瘤裸鼠体内生物分布

18F-Ta-Gluc-TOCA在荷AR42J瘤裸鼠体内分布结果列于表2。由表2可以看出，18F-Ta-Gluc-TOCA在荷瘤裸鼠体内的分布基本与正常小鼠体内分布一致，在肝和肾有较高的摄取，在60 min时肝脏为3.28%ID·g-1，肾脏为2.41%ID·g-1，主要通过肝代谢，血液清除较快，在其他器官摄取较低。18F-Ta-Gluc-TOCA在肿瘤中的摄取较高，60 min时达到4.34%ID·g-1，在120 min时仍保持较高摄取。

18F-Ta-Gluc-TOCA在荷AR42J瘤裸鼠体内分布的T/NT结果列于表3。由表3可以看出，肿瘤与肝脏、肾脏两个主要的代谢器官的T/NT稍小；在120 min时的T/NT增大。T/NT随时间而增大主要是由于18F-Ta-Gluc-TOCA 在120 min时肿瘤中的摄取仍然较高，下降不明显，在组织或器官中的摄取均明显降低，说明18F-Ta-Gluc-TOCA在肿瘤内保留时间较长，在肿瘤中的高摄取使其有望用于生长抑素受体阳性肿瘤PET显像。

表1 18F-Ta-Gluc-TOCA的正常小鼠体内分布

表2 18F-Ta-Gluc-TOCA的荷瘤裸鼠体内分布数据Table 2 Biodistribution of 18F-Ta-Gluc-TOCA in tumor bearing nude mice

肿瘤与器官T/NT60 min120 min肿瘤/心3.13±0.8113.28±3.18肿瘤/肝1.32±0.102.07±0.36肿瘤/肺3.47±0.887.94±2.30肿瘤/肾1.81±0.216.80±0.64肿瘤/胃3.64±0.956.21±2.14肿瘤/肌肉13.77±3.4313.62±2.33肿瘤/股骨2.83±0.292.98±0.77肿瘤/血3.56±0.4712.38±2.31

4 结论

本研究采用点击化学法制备了18F标记的奥曲肽类似物18F-Ta-Gluc-TOCA放化纯度高，稳定性较好，亲水性得到了一定改善。18F-Ta-Gluc-TOCA在血液中清除较快；主要通过肝脏代谢，部分经肾脏代谢，在其他器官或组织摄取均较低；在肿瘤中摄取较高，而且在120 min时仍有较高的摄取，18F-Ta-Gluc-TOCA在肿瘤中的高摄取可以使其成为一种较好的显像剂。18F-Ta-Gluc-TOCA制剂在骨中有少量摄取，稳定性有待提高；由于点击化学反应以及引入的丙炔酸结构使其亲脂性进一步增加，18F-Ta-Gluc-TOCA肝脏摄取较高，在以后的研究中可以对奥曲肽结构进一步改进。

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