牛传染性鼻气管炎病毒gD基因截短表达及其抗血清制备

张 辉，宋玲玲，杨宏军，王洪梅，武建明，候佩莉，何洪彬＊，王立群

（1.东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨150030；2.山东省农业科学院 奶牛研究中心，山东 济南250100）

牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectiousbovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病，表现为上呼吸道及气管粘膜发炎、呼吸困难、流鼻汁等症状，可引起脓疱性外阴阴道炎、龟头炎、结膜炎、幼牛脑膜炎、乳房炎、流产等［1-3］。该病在世界范围内流行，1980年我国从新西兰进口牛中分离到该病毒，目前该病在我国大部分省区呈上升趋势。其对牛群肥育率、产奶量及繁殖带来极大的影响，给全球养牛业造成了巨大的经济损失［4］。该病的危害在于病毒侵入牛体后，可潜伏于三叉神经节造成潜伏感染，病毒的潜伏感染使病牛终身带毒并周期性向外排毒，给疾病的防治带来很大困难［5-6］，为此IBR被世界动物卫生组织（OIE）列为B类传染病，也是我国进出境动物和国际动物贸易中规定的重点检疫对象［7］。因此加强IBR诊断技术的研究和药物开发对预防和控制该病具有重要的意义。

IBRV属疱疹毒科（Herpesviridae）α-疱疹病毒亚科（Alpha-herpesvirinae），IBRV基因组为双股线性DNA 分子，约138 kb［3］。IBRV 大约编码40种结构蛋白，有11种为糖蛋白，其中gD蛋白是IBRV的主要糖蛋白，是病毒粒子表面和病毒感染细胞的主要分子［8］，与病毒穿透、进入宿主细胞有关，能引起宿主体液免疫与细胞免疫［9］。与其他相关的几种糖蛋白比较，gD糖蛋白可大大地降低病毒的复制和释放，抗gD抗体中和病毒效果最好，显示较好的中和滴度［10］。研究表明，去除信号肽和跨膜区等强疏水序列可明显提高蛋白的可溶性和表达量，并且分泌形式的蛋白能引起机体更高水平的免疫反应［11］。截短表达的可溶性gD蛋白可直接作为抗原建立IBRV的血清学检测方法，同时可免疫动物制备高免血清或试制亚单位疫苗。为此，本试验对gD基因主要抗原表位区进行截短表达，免疫兔子制备抗血清并初步验证其抗病毒能力。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种、质粒、病毒、细胞 大肠杆菌感受态DH5α、BL21（DE3）均购自宝生物工程（大连）有限公司；p ET32a（＋）质粒表达载体，pc DNA3.1（＋）载体、IBRV、293T细胞、牛肾传代细胞MDBK均由山东省农业科学院奶牛中心实验室保存。

1.1.2 试剂 LA Taq酶、T4DNA连接酶及其它限制性内切酶、病毒基因组DNA提取试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒提取及胶回收试剂盒购自Biomega公司；Ni-NTA蛋白纯化系统为Qiagen公司；弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体均为Sigma产品。

1.2 方 法

1.2.1 病毒基因组DNA的提取 将100TCID50 IBRV（TCID50＝10-7.62／0.1m L）接种于 MDBK 单层细胞，待细胞病变达80%时反复冻融三次，然后按病毒基因组DNA提取试剂盒说明书操作，提取IBRV基因组DNA。

1.2.2 引物合成 根据GenBank公布的IBRV基因组序列（GenBank登录号：NC001847），利用分子生物学分析软件分析g D基因的跨膜区、亲水区及表面展示概率选取抗原决定簇较集中且抗原性较强的亲水序列作为表达基因，片段长为786 bp，利用引物设计软件设计一对特异性引物（gD-F：5＇-ATGGATCCTTCGCCTACCCCACGGAC-3＇；gD-R：5＇-GCAAGCTTGTTGACGTTGCCAAAGGCC-3＇，引物中引入Bam HⅠ、HindⅢ酶切位点）。同时以IBRV基因组为模板设计一对扩增gD基因全长用于真核表达的引物（pc-gD-F：5＇-CTCAAGCTTGCCACCATGgactacaaggacgacgatgacaag ATGCAAGG GCCGACATT-3＇；pc-gD-R：5＇-CGCGAATTCGAGGAGGGCCTAGACCGC-3＇，引物中引入HindⅢ酶切位点，EcoRI酶切位点）。引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成。

1.2.3 g D基因表达载体的构建与鉴定

1.2.3.1 原核表达载体的构建与鉴定 以提取的IBRV基因组DNA为模板，用设计的引物PCR扩增截短gD主要抗原表位区基因，产物纯化后用Bam HⅠ／HindⅢ双酶切，然后用T4连接酶将该片段与同样双酶切的p ET32a（＋）表达载体连接。转化DH5α感受态细胞，挑选阳性重组子，提取重组DNA质粒进行Bam HⅠ／HindⅢ双酶切鉴定。将鉴定正确的重组DNA质粒进行序列测定，阳性质粒命名为p ET32a-gD。

1.2.3.2 真核表达载体的构建与鉴定 以提取IBRV基因组DNA为模板，用设计引物PCR扩增gD全基因，产物纯化后用Hind III／EcoRI双酶切，定向连接到经Hind III／EcoRI双酶切的pcDNA3.1（＋）表达载体中，挑选阳性重组子，提取重组DNA质粒进行Hind III／EcoRI双酶切鉴定，提取质粒并序列测定，阳性质粒命名为pcDNA3.1-gD。

1.2.4 gD重组蛋白的诱导表达及可溶性分析 取测序正确的阳性重组质粒p ET32a-gD转化BL21（DE3），挑取单菌落接种于5 m L含0.1%氨苄LB中，37℃过夜培养至OD600值为0.6～1.0。过夜菌1%接种于5 m L含0.1%氨苄LB中，190 r／min、37℃培养至OD 600到0.4～1.0之间时，收集1 m L菌液作为未诱导对照。剩余菌液加入IPTG至终浓度1 mmol／L，30℃诱导6 h后取1 m L菌液，离心取菌体用SDS-PAGE检测目的蛋白表达。

重复上述方法诱导表达后收集菌体，用预冷的PBS洗三遍，超声破碎细胞，1 200 r／min离心15 min后分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，鉴定目的蛋白是以可溶形式存在于上清中，还是以包涵体存在于沉淀中。

1.2.5 融合蛋白p ET32a-gD的纯化 以最佳诱导条件表达蛋白，10 000 g／min收集5 m L诱导后的菌体，加入630μL裂解缓冲液、70μL溶菌酶、10 μLPMSF（100 m M）、1μL胃蛋白酶抑制剂、1μL胰蛋白酶抑制剂，重悬菌体，超声破碎细胞（工作2 s：停止6 s），当菌液变为半透明时13 000 r／min离心30 min收集上清，依照Ni-NTA纯化试剂盒说明书纯化p ET32a-gD蛋白。

1.2.6 抗p ET32a-gD蛋白多克隆抗体的制备 选取3月龄雄性新西兰兔2只，免疫前耳部取血作为阴性对照。将纯化的p ET32a-gD蛋白与p ET32a（＋）空载蛋白各1 mg分别与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化。采取背部皮内多点注射进行第一次免疫；一周后用弗氏不完全佐剂乳化蛋白，双侧后肢注射进行第二次免疫；10 d后背部皮内多点注射加强免疫；加强免疫一周后心脏取血，3 500 r／min、4℃离心10 min分离血清，分装后-20℃冻存。

1.2.7 多克隆抗体效价测定及特异性检测 采用间接ELISA法测定抗体效价。将纯化的p ET32agD蛋白与p ET32a（＋）空载蛋白分别适当稀释后，每孔100μL（1μg）包被96孔酶标板，4℃过夜，用PBST室温洗涤酶标板3次，每次3 min；1%BSA 37℃封闭2 h，洗涤同上，加倍比稀释待检血清，以未免疫兔血清作为阴性对照，37℃作用2 h，洗涤同上；加HRP标记的山羊抗兔IgG（1：4 000稀释）37℃作用2 h，洗涤同上；每孔加入TMB 50μL 37℃避光显色10 min，加50μL 2 M硫酸终止液，用酶标仪在450 nm波长下测定OD值。

将pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1-gD质粒分别转染293T细胞，参照Lipofectamine TM2000转染说明书操作，转染24 h后收集细胞，SDS-PAGE凝胶电泳后转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜，加入抗血清（1∶1 000稀释）37℃摇床孵育2 h。TBST缓冲液洗3次，每次5 min，加入羊抗兔IgG辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（1∶5 000稀释）37℃摇床孵育2 h，TBST缓冲液洗3次，加入ECL显色，暗室曝光。

1.2.8 病毒毒价测定及血清中和试验 采用TCID50法测定IBRV毒价，将病毒连续10倍稀释（10-1～10-10）；接种 MDBK细胞悬液100μL到96孔板中，使细胞量达到2～3×105个／m L；将稀释好的病毒接种到96孔板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100μL，同时设两纵排空白对照；连续5 d观察并记录CPE孔数，Karber法计算毒价。

MDBK细胞悬液铺96孔微量培养板；将免疫后血清2倍稀释，加等量已知毒价的病毒液（与血清混合后，每一接种剂量含100TCID50的IBRV病毒），摇匀置于37℃作用1 h后接种MDBK细胞；设空白和100TCID50接毒对照组，连续5 d观察并记录细胞状态。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增及表达载体鉴定结果

以IBRV全基因组DNA为模板扩增gD基因PCR结果见图1A，扩增截短gD基因PCR结果见图1B，表达载体p ET32a-gD用Bam HⅠ／HindⅢ双酶切见图1C，pcDNA3.1-gD Hind III／EcoRI双酶切鉴定结果见图1D，PCR扩增片段与酶切鉴定结果均与预期相符。

图1 gD基因扩增结果及其重组表达载体鉴定M1.DNA Maker DL2 000；M2.DNA Maker DL10 000；1.gD基因扩增结果；2.截短后gD基因扩增结果；3.重组表达质粒p ET32a-gD的酶切鉴定；4.pcDNA3.1-g D双酶切鉴定Fig.1 PCR products of gD gene and its identification of recombinant expression vectorM1.DNA Maker DL2 000；M2.DNA Maker DL10 000；1.PCR products of gD gene；2.PCR products of truncated gD gene；3.Identification of recombinant p ET32a-gD plasmid digested by Bam HⅠ／HindⅢ；4.The double digestion of pcDNA3.1-gD by Hind III／EcoRI

2.2 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析

阳性重组质粒p ET32a-gD与p ET32a（＋）分别转化BL21（DE3）表达菌株，IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析，结果显示与未诱导组相比重组蛋白大量表达且与预期蛋白大小相一致。可溶性分析表明，该融合蛋白主要以包涵体形式存在，部分以可溶形式存在（图2）。

2.3 重组蛋白的纯化

以最适诱导表达条件大量表达融合蛋白pET32a-gD和空载蛋白p ET32a（＋），采用 Ni-NTA非变性条件下纯化蛋白（图3），经测定蛋白浓度为0.21 mg／m L。

2.4 抗p ET32a-gD蛋白多克隆抗体效价及特异性

图2 pET32a-g D诱导表达及可溶性分析Fig.2 p ET32a-gD inducing expression and solubility analysis M.Standard protein Marker；1.Non-induced BL21 lysate of p ET32a（＋）；2.Non-induced BL21 lysate of p ET32a-gD ；3.Induced BL21 lysate of p ET32a-gD；4.Culture supernatants of BL21；5.Sediment of culture

图3 p ET32a-gD蛋白非变性条件纯化Fig.3 p ET32a-gD protein was purified under native conditions M.Standard protein Marker；1.Culture supernatants of BL21；2.Protein bind to the NI-NTA resins；3.150-m M imidazole elution；4.250-m M imidazole elution

将抗血清用间接ELISA法检测效价，结果显示该抗血清的效价为1：6400。将pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1-gD质粒分别转染293T细胞用以表达完整gD糖蛋白，以免疫新西兰兔后获得的抗血清作为一抗，通过Western-blot检测该抗血清的特异性，结果如图4。从图4可看出，明显特异条带，该抗血清具有明显的特异性。

2.5 抗血清功能活性检测

血清中和试验来初步验证该抗血清抗病毒的活性，Karber法计算实验室保存的IBRV毒株TCID50＝10-7.62／0.1 m L。将该抗血清2倍稀释，加等量100TCID50的IBRV病毒液，摇匀后置于37℃作用1 h，接种MDBK细胞连续5 d记录细胞病变孔数，统计数据见表1，计算该抗血清中和价为1∶640。

图4 抗血清Western-blot检测Fig.4 Western-blot analysis of gD reactivity to antiserum M.Standard protein Marker；1.pcDNA3.1-gD protein；2.pcDNA3.1（＋）protein

表1 血清中和试验细胞病变（CPE）孔数统计Table 1 Statistics for the number of cytopathic effect（CPE）holes in the serum neutralization test

3 讨 论

gD糖蛋白是IBRV的主要结构蛋白，是刺激机体产生中和抗体的最主要的糖蛋白并且与病毒感染和复制紧密相关。有研究显示抗该蛋白的单克隆抗体中和IBR病毒有较高的滴度，Hutchings等［12］分别用gB、gC和gD免疫鼠和牛，结果显示gD糖蛋白与其它糖蛋白相比有更高而持久的细胞免疫。以可溶形式截短表达的gD蛋白具有天然构象，纯化后可作为抗原筛选针对gD的单克隆抗体。也可以直接作为抗原建立IBRV gD糖蛋白的血清学诊断方法，可用于IBR的诊断及疫苗免疫效力的评价。祖立闯等［13］以截短表达的gD蛋白作为抗原建立IBRV间接ELISA检测方法，与全病毒ELISA相比较具有较高的敏感性和特异性。此外，该蛋白也可免疫易感动物制备高免血清用以开发高效治疗传染性牛鼻气管炎药物，也可以成为亚单位疫苗的候选基因。以上表明gD蛋白是研究IBRV首选的特异性抗原。

本试验利用生物学软件分析gD基因主要抗原表位区，PCR方法扩增786 bp片段，定向连接到p ET32a（＋）表达载体中，并利用大肠杆菌表达系统BL21（DE3）诱导表达了大量融合蛋白，非变性条件下纯化可溶性蛋白，具有天然的空间构象，免疫兔子制备的抗血清通过ELISA和Western-blot检测具有较高效价和特异性，利用血清学中和实验初步验证该抗血清的功能，结果显示该抗血清能明显抑制病毒的感染复制，可初步将本试验截短的gD基因作为研究IBRV亚单位疫苗的候选基因，为进一步开发IBR的诊断检测试剂和亚单位疫苗奠定了重要基础。

［1］ Tikoo S K，M Campos，L A Babiukn.Bovine Herpesvirus-1（BHV-1）Biology，Pathogenesis，and Control［J］.Advances in Virus Research，1995，45：191-223.

［2］ Gibbs E P J，Rweyemammu M M.Bovine herpesvirus-1［J］.Vet Bull，1997，47：317-343.

［3］ 殷 震，刘景华.动物病毒学［J］.2版 .北京：科学出版社，1997.

［4］ Ackermann M，Engels M.Pro and contra IBR-eradication［J］.Vet Microbiol，2006，1 1 3（3-4）：293-302.

［5］ Belknap E B，Walters L M，Kelling C，et al.Immunogenicity and protective efficacy of a gE，gG and US2 gene-deleted bo-vine herpesvirus-1（BHV-1）vaccine［J］.Vaccine，1999，17（18）：2 297-2 305.

［6］ Lasse Nuotio，Erkkineuvonen，Mauno Hyyti Inen.Epideiology and eradication of infectious bovine rhinotracheitis／infectious pustularvulvovaginitis（IBR／IPV）virus in Finland［J］.Acat Vet Scand，2007，49（1）：3.

［7］ 于大海，崔砚林.中国进出境动物检疫规范［M］.北京：中国农业出版社，1997.

［8］ Christine D Mullaney，David H Francis.Comparison of seroagglutination，ELISA，and indirect fluorescent antibody staining for the detection of K99，K88，and 987P pilus antigens of Escherichia coli［J］.J Vet Diagn Invest，1991，3：115-118.

［9］ Van Drunen Littel-van den Hurk S，Braun R P，Lewis P J，et al.Intradermal immunisation with a bovine herpesvirus-1 DNA vaccine induces protective immunity in cattle［J］.J Gen Virol，1998，79：831-839.

［10］ Abdelmagid O Y，Orten D J，Xue W，et al.An ti-idiotypic antibodies to bovine herpesvirus 1 inhibit virus infection in cell cultures［J］.Arch Virol，1992，122：163-173.

［11］ Braun R，Babiuk L A，van Drunen Littel-vanden Hurk S.Enhanced Immune response to an intradermally delivered DNA vaccine expressing a secreted form of BHV-1 g D［J］.Vaccine Res，1997，6：151-164.

［12］ Hutchings D L，van Drunen Little-van den Hurk S，Babiuk L A.Lymphotlyte proliferative responses to separate bovine herpesvirusⅠproteins in immune cattle［J］.J virol，1990，64：5 114-5 122.

［13］ 祖立闯，朱远茂，王延辉，等.牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA方法的建立及应用［J］.中国预防兽医学报，2008，30（7）：538-543.