自体DC-CIK联合膀胱内吡柔比星灌注治疗对浅表性膀胱癌术后复发和生存的影响

杨森，南存金，木海琦，王怡君，苏红侠，陈映鹤

（温州医科大学附属第二医院 泌尿外科，浙江 温州 325027）

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其中70%为浅表性膀胱癌。手术是浅表性膀胱癌治疗的主要手段，但是术后复发率高，严重影响了患者术后的生存率[1-2]。目前临床广泛采用吡柔比星等药物行膀胱内灌注化疗，对预防浅表性膀胱癌术后复发具有一定的疗效[3]。随着细胞免疫治疗在临床上的开展，以树突状细胞（dendritic cells，DC）和细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer，CIK）为主的免疫细胞治疗被应用于预防原发性肝脏淋巴瘤和进展性肾癌术后复发，并取得了显著的疗效[4-5]。本研究将DC-CIK免疫细胞治疗与吡柔比星膀胱内灌注治疗联合用于预防膀胱癌术后复发，并探讨了其对术后患者生存率等的影响，现报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 我院于2009年6月到2012年6月共收治浅表性膀胱癌手术患者122例。入选标准：①患者术前均通过膀胱镜检查和病理学确诊；②均为初发肿瘤患者；③所有患者术后治疗均签署知情同意书。122例患者按照术后治疗方式分为对照组和观察组，对照组53例，其中男28例，女25例；年龄26～80岁，平均（62.5±12.1）岁；肿瘤单发43例，多发10例；手术方法：经尿道膀胱肿瘤切除术32例，经尿道膀胱肿瘤汽化术13例，接触式激光膀胱肿瘤切除术 8例；术后病理分期：Ta25例，T119例，Tis9例。观察组69例，其中男39例，女30例；年龄25～82岁，平均（63.1±12.6）岁；肿瘤单发62例，多发7例；手术方法：经尿道膀胱肿瘤切除术46例，经尿道膀胱肿瘤汽化术12例，接触式激光膀胱肿瘤切除术11例；术后病理分期：Ta34例，T121例，Tis14例。两组患者年龄、性别、肿瘤数量、手术方式及术后病理分期比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 DC-CIK细胞的体外扩增：采用血细胞分离机从患者外周血中分离单个核细胞，用淋巴细胞分离液进行纯化后，细胞贴壁培养2 h。收集未贴壁的细胞，贴壁的细胞加入含GM-CSF 1000 U/mL、IL-4 500 U/mL、TNF-α500 U/mL的PRMB 1640培养基，每4 d更换培养基1次，连续培养8～12 d后即为DC。将上述未贴壁细胞浓度调整为2.5×106/mL，加入INF-γ1000 U/mL，第2天加入IL-1α100 U/mL、IL-2500 U/mL、CD3单抗50 ng/mL，每3 d更换培养基1次，连续培养8～12 d后即为CIK细胞。将培养第9天的DC和CIK细胞按照1:5比例混合培养3 d，开始回输。

细胞回输质控标准：培养第9天流式细胞术检测CIK细胞CD3+CD56+≥50%，CD3+CD8+≥30%; DC CD80+、CD83+、CD86+、CD1α+、HLA-DR+细胞比例≥50%；细胞活力≥95%；不含细菌和内毒素。

1.2.2 对照组治疗方法：对照组给予膀胱内灌注吡柔比星治疗。方法如下：患者术后1周开始予吡柔比星（10 mg/支，深圳万乐药业有限公司）30 mg/次膀胱内灌注，1周1次，共10次，此后每个月灌洗1次，连续灌洗10个月，总疗程为12个月。

1.2.3 观察组治疗方法：患者术后先接受10周的膀胱内灌注吡柔比星（即术后1周开始30 mg/次剂量行膀胱灌注，1周1次，共10次），然后静脉输注DC-CIK细胞5×109/次，连续输注3 d，1次/d，3次为一个疗程。此后膀胱内灌注吡柔比星化疗每月1次，在每2个月化疗间隙给予患者一个疗程的DCCIK免疫细胞治疗，总疗程为12个月，其中DC-CIK治疗总计5个疗程。

1.3 观察指标及评定标准 分别对两组术后累积复发率、累积生存率、不良反应及患者的免疫功能进行评定。免疫功能评定方法：分别在治疗前后采集患者外周血，采用流式细胞术对患者外周血CD3、CD4、CD8阳性细胞的比例进行检测。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS13.0统计学软件进行分析。计量资料以 ±s表示，采用t检验，计数资料比较采用卡方检验，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-Rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组术后累积复发率和生存率比较 对照组术后1年和2年累积复发率分别为33.96%和73.58%，观察组术后1年和2年累积复发率分别为18.18%和55.07%，如图1A所示。对照组术后1年和2年累计生存率分别为33.96%和45.28%，观察组术后1年和2年生存率分别为4.47%和26.09%，如图1B所示。

2.2 两组患者治疗前后免疫功能分析 结果如表1所示，对照组和观察组术后接受治疗前外周血CD3、CD4和CD4/CD8比值等指标比较差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组术后接受膀胱内灌注吡柔比星治疗后外周血CD3、CD4和CD4/CD8比值等指标较治疗前有所下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。观察组术后接受细胞免疫治疗和膀胱内灌注吡柔比星治疗后CD3、CD4和CD4/CD8比值等指标较治疗前和对照组术后明显增加，差异有统计学意义（均P＜0.05）。两组CD8治疗前后差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 两组不良反应比较 对照组24例出现不良反应，主要表现为尿急、尿频和尿痛等；观察组20例出现不良反应，以尿急、尿频和尿痛为主。DC-CIK治疗并未引起明显不良反应。

图1 两组患者治疗后累积复发率和生存率比较

表1 两组术后治疗前后外周血CD3、CD4和CD4/CD8比值变化

3 讨论

膀胱癌近年来发病率呈现明显的上升趋势，位居泌尿系统肿瘤首位。膀胱癌手术后肿瘤的复发率极高，且部分患者复发后出现肿瘤分期、分级提高，浸润能力增强，给后期治疗带来了困难，也严重缩短了患者的生存时间。

吡柔比星是常用的膀胱内灌注化疗药物之一，其属于葸环类抗肿瘤抗生素，可进入肿瘤细胞抑制DNA合成，使肿瘤细胞增殖终止于G2期，最终使肿瘤细胞凋亡和坏死。吡柔比星在肿瘤细胞中扩散速度快，通过膀胱内灌注可有效进入肿瘤细胞，消除原位肿瘤残余病灶，达到预防术后复发的目的[6-7]。单纯膀胱内灌注吡柔比星预防浅表性膀胱癌术后复发虽有效果，但是术后复发率仍然较高。

DC-CIK细胞免疫疗法是目前较为理想的过继免疫治疗方案[8]。DC是人体内功能最强且是唯一能呈递蛋白质抗原的抗原递呈细胞，可有效诱导机体抗肿瘤免疫反应[9]。CIK细胞具有与细胞毒T淋巴细胞相似的杀肿瘤细胞活性，其不受机体主要组织相容抗原（MHC）的限制，可以非特异性识别靶细胞，杀伤肿瘤细胞[10]。

本研究将吡柔比星膀胱内灌注化疗与DC-CIK细胞免疫疗法相结合，分析了其对浅表性膀胱癌患者术后复发和生存情况的影响，结果显示膀胱内灌注吡柔比星与DC-CIK联合治疗患者术后复发率明显下降，而生存率明显升高，提示DC-CIK联合膀胱内灌注吡柔比星对于浅表性膀胱癌术后复发有较好的疗效。肿瘤患者存在机体免疫力低下和功能紊乱，表现为CD3+、CD4+阳性T淋巴细胞比例下调，CD4/CD8比值明显下降[11]。本研究结果显示，观察组患者在接受DC-CIK细胞免疫治疗后CD3+、CD4+阳性T淋巴细胞比例及CD4/CD8比值明显增加，提示患者机体免疫功能提高，对杀伤残留肿瘤细胞，降低术后复发率具有重要的意义。

综上所示，DC-CIK联合膀胱内灌注吡柔比星可显著降低表浅性膀胱癌术后复发率，提高患者术后生存率，值得临床推广使用。

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