超声提取白刺中总生物碱及大孔树脂纯化的工艺研究

王玉玲，曾会明，张建秋，马挺军

（1.北京林业大学，北京 100083；2.白城市林业科学院，吉林 白城 137000；3. 北京农学院 食品科学学院，北京 102206）

超声提取白刺中总生物碱及大孔树脂纯化的工艺研究

王玉玲1，曾会明1，张建秋2，马挺军3

（1.北京林业大学，北京 100083；2.白城市林业科学院，吉林 白城 137000；3. 北京农学院 食品科学学院，北京 102206）

为优化西伯利亚白刺种籽中总生物碱的提取工艺，采用超声波提取总碱，以硫酸阿托品为对照品，酸性染料比色法测定白刺中总生物碱的含量，探讨料液比、提取温度、时间、乙醇浓度4个因素的影响，确定最佳提取参数。从7种大孔吸附树脂中筛选出对白刺生物碱有最佳分离纯化效果的一种树脂，研究其对生物碱静态、动态吸附、解析效果。研究结果表明，当料液比为1:20，温度60℃，时间40 min，乙醇浓度70%时，总生物碱提取率(生物碱/种籽重)最高，217.372 9 μg/g；D101对白刺总生物碱的吸附、解析效果最好，对其进行动态吸附，可知最佳的工艺条件为上样液pH值为5，流速为0.75 mL/min，乙醇的洗脱浓度为80%。

西伯利亚白刺；超声波；生物碱；大孔树脂

白刺属植物是蒺藜科下的一个古老小属，为多分枝的耐盐喜潜水的旱生落叶小灌木，根据化石花粉研究属第三纪孑遗植物，是中亚大陆荒漠地带的典型植被。白刺果实在民间被用于治疗脾胃虚弱、神经衰弱、消化不良、感冒等症状[1]，经研究发现唐古特白刺果具有调解血糖、血脂, 降血压,提高人体免疫力,抗疲劳、抗寒冷,增进睡眠程度等功效[2]，其叶则作为民间药，用于治疗痉挛、神经痛和心律不齐等症[3]。有研究文献记载白刺

中含有卡波林类生物碱等多种化学成分[4-6]，其地上部分含有的生物碱经动物试验表明对麻醉犬和麻醉猫具有降低血压的作用[7]。在利用白刺果实的时候，能产生大量的白刺种籽，目前已开展了多种关于白刺育苗的实验研究，如播种量、覆土厚度、施肥量等[8]，但对白刺种籽其他方面的研究却少之又少，因此本文采用超声波法提取西伯利亚白刺种籽中的生物碱，酸性染料比色法测定其中总生物碱的含量。

大孔树脂吸附技术是20世纪70年代发展起来的一种新工艺，是将中草药提取液通过大孔树脂，吸附其中的有效成分，再经洗脱回收，除掉杂质的一种纯化精制方法[9-11]。将其应用于分离纯化，具有物理化学选择性好，比表面积大，稳定性高，吸附速度快，解吸条件温和，再生处理方便，使用周期长，宜于构成闭路循环、节省费用等优点[12-13]，本文从7种大孔树脂中筛选出适合白刺总生物碱分离纯化的类型，并确定最佳工艺条件，为进一步开发利用白刺提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

原料： 西伯利亚白刺种籽由吉林省白城市林科院提供，在105 ℃的干燥箱中烘烤2 h后粉碎，过60目筛，备用。

主要试剂： 硫酸阿托品，购自中国药品生物制品检定所；无水乙醇、无水碳酸钠、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯，购自北京化工厂；水为超纯水。

主要设备： KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪RE-200B，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-Ⅲ型循环水式多用真空泵，上海知信实验仪器技术有限公司；台式低速离心机（TW5A-WS），长沙湘仪离心机仪器有限公司；横流泵（HL-2），上海嘉鹏科技有限公司；紫外-可见分光光度计（TU-1810），北京普析通用仪器有限公司；pH计，上海精密仪器仪表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 西伯利亚白刺中总生物碱含量的测定

（1）溴甲酚绿的制备 精密称取溴甲酚绿0.125 g于250 mL三角瓶中, 用0.2 mol/L的氢氧化钠溶解，加入领苯二甲酸氢钾2.55 g， 加水至接近250 mL，用2%的盐酸调pH值至4.42，定容至250 mL。

（2）标准曲线的绘制 精密称取硫酸阿托品0.025 g，置于小烧杯中，加水溶解后转移至25 mL的容量瓶中，定容至刻度，量取5 mL置于100 mL容量瓶中，定容至刻度，即得50.0 μg/mL的对照品溶液。

分别取上述溶液0、1、2、3、4、5 mL于10 mL的试管中，各加氯仿定容至6 mL，分别加4 mL溴甲酚绿溶液，转移至分液漏斗中，加15 mL氯仿，震荡3 min,静置30 min,使水层和氯仿层分清后，取氯仿层至25 mL容量瓶中，定容。以第一份为空白，第二份在300～500 nm内光谱扫描，得知在415.5 nm处有最大吸收值，因此选415.5为含量测定的最大波长。以第一份为空白，在415.5 nm处测吸光值，绘制标准曲线。

（3）白刺总生物碱的提取及含量的测定 取西伯利亚白刺粉末5 g，加入一定量的乙醇超声处理，离心，取滤液，旋转蒸发浓缩得糖浆状，用2%的HCL溶解，合并酸水液，过滤，滤液以5%的碳酸钠碱化至pH值 9～10，用氯仿（每次20 mL）萃取3次，合并氯仿液，旋转蒸发浓缩，将浓缩液定容至5 mL，取1 mL于10 mL的试管中，用氯仿补足6 mL，加4 mL溴甲酚绿溶液，转移至分液漏斗中，加15 mL氯仿，震荡3 min，静置30 min，使水层和氯仿层分清后，取氯仿层至25 mL容量瓶中，定容，在415.5 nm处测吸光度。然后根据标准曲线，找出所得吸光值对应的生物碱浓度，进而计算总生物碱的含量。

1.2.2 提取工艺的优化

(1) 单因素实验 准确称取白刺粉末5g，分别考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、提取温度（30、40、50、60、70℃）、提取时间（20、30、40、50、60 min）、乙醇浓度（50、60、70、80、90、100%）对白刺生物碱提取率的影响。

(2) 正交实验 通过单因素实验，得到影响白刺生物碱的单因素的最佳提取条件，在此基础上，采用四因素三水平的L9(34)正交实验做进一步的优化，具体的因素水平见表1：

表1 正交实验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design

1.2.3 大孔树脂型号的筛选

供试品溶液的配制 取白刺粉末10 g，在上述确定的最佳工艺条件下超声提取后，离心，取滤液，旋转蒸发浓缩得糖浆状，用2%的HCL溶解，合并酸水液，过滤，定容至100 mL，作为供试液。取1 mL上述提取液于10 mL的磨口试管中，按1.2.1步骤在415.5 nm处测吸光度，计算提取液中总生物碱的浓度。

静态吸附 准确称取各种型号的湿树脂2 g，分别装入100 mL的三角瓶中，加入20 mL的上述供试液，将三角瓶放入摇床中，在90 次/min的震速下震荡吸附24 h，将吸附后的白刺提取液真空抽滤，滤液按1.2.1步骤在415.5 nm处测吸光度。将抽滤后的湿树脂倒回三角瓶中，加入40 ml 95%乙醇，震荡解吸24 h，解吸后的样品真空抽滤，将乙醇旋转蒸发后，用20 ml 2%的HCL溶解，然后按1.2.1步骤在415.5 nm处测吸光度。

各种树脂的吸附率和解析率按以下公式计算：

式（1）～（2）中：k吸为吸附率，k吸初为吸附液初浓度；k吸后为吸附后溶液的浓度；k解为解析率；k解后为解吸后溶液浓度。

1.2.4 均匀设计纯化生物碱的工艺研究

根据上述静态吸附帅选出的树脂类型，及考虑白刺生物碱的化学结构和性质，试验选择D101型大孔树脂进行分离、纯化生物碱。影响白刺生物碱提取纯化效果的因素主要有上柱样品液的pH值、流速、洗脱液（乙醇）浓度等，故选择上述三个因素进行考察，每个因素选5个水平进行均匀设计试验，以总生物碱的保留率为指标，优选出最佳的纯化工艺条件，因素水平表如下：

表2 均匀设计试验因素水平Table 2 Factors and levels of uniform design

将树脂用蒸馏水冲洗，使其充分溶胀，然后倒入一定的蒸馏水，抽真空，取处理好的树脂湿法装柱，将上柱样品液用1 mol/L的HCL和1 mol/L的NaOH调至预定的pH值（以pH值计精准测定），精密量取60 ml的样品液上柱，并按因素水平表设定流速，先以清水洗脱杂质，再用预定浓度的乙醇洗脱，最后收集洗脱液，按1.2.1方法测定其中生物碱的含量。

2 结果和分析

2.1 绘制标准曲线

按1.2.1方法，以测得的吸光度为纵坐标，硫酸阿托品含量为横坐标，作标准曲线(如下图)，计算得回归方程为y=0.047 2x-0.011 0,R2=0.999 3，表明硫酸阿托品溶液浓度在2.0～10.0 ug/ml时，浓度与吸光度线性关系良好。

图1 浓度与吸光度的标准曲线Fig.1 Standard curve of concentration and absorbance

2.2 单因素实验

2.2.1 不同料液比对总生物碱提取效果的影响

由图1可知，白刺总生物碱的提取量随料液比的增大而先增大后减少，在1∶20时达到最大，这可能是因为随料液比的增大，细胞内外的浓度差越大，内扩散的速率也就越大，越有利于生物碱的溶出，所以开始时生物碱的提取量是增大的，但当溶剂太多时，超声波辐射被溶剂大量吸收，而不能完全作用于物料，从而影响生物碱的提取量，且料液比太大也会浪费溶剂的使用，因为正交试验选取1∶15、1∶20、1∶25较为合适。

图2 料液比对总生物碱含量的影响Fig. 2 Effects of ratios of solvent to material on yield of total alkaloids

2.2.2 不同提取温度对总生物碱提取效果的影响

由图2可知，随着温度的提高，白刺总生物碱的提取量也不断升高，但到70℃时升高的幅度不大，可能是温度太高会使生物碱的结构不稳定，发生分解，另外，温度太高，乙醇挥发也会要严重，也会影响生物碱的提取，从工厂的实际生产来来考虑，做正交试验时选取40、50、60℃为宜。

2.2.3 不同提取时间对总生物碱提取效果的影响

图3 温度对总生物碱含量的影响Fig. 3 Effect of temperature on yield of total alkaloids

由图3可知，随着超声时间的延长，白刺总生物碱的提取量先增加后减少，在50 min时达到最大，可能是随着时间增长，可溶性成分溶出的就越多，使得提取粘液度增大，另外时间太久也会使生物碱的结构遭到破坏，时间太少，提取的生物碱含量又太少，因此选40、50、60 min做正交试验。

图4 时间对总生物碱含量的影响Fig 4 Effect of time on yield of total alkaloids

2.2.4 不同乙醇浓度对总生物碱提取效果的影响

由图4可知，随乙醇浓度的增加，提取生物碱的含量是先增加后减少，在70%处达到最大，其原因可能与白刺中所含生物碱的种类及极性有关，正交试验时选60%、70%、80%为宜。

图5 乙醇浓度对总生物碱含量的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on yield of total alkaloids

2.3 正交实验

通过表3的正交试验结果可知，确定西伯利亚白刺种籽生物碱超声提取的最佳工艺组合为A2B3C1D2，即料液比为1∶20，温度60℃，时间为40 min，乙醇浓度70%，每克白刺粉末中含总生物碱的量为217.372 9 ug，李方群，刘金荣等[14]曾测得西伯利亚白刺叶子中总生物碱平均含量为0.57%，成熟果实中0.022%（即220 μg/g），未成熟果实中0.004%，本文中所测得的生物碱含量与其成熟果实中近似，这说明成熟果实中的生物碱主要分布在种籽内；由方差分析可知，超声提取白刺生物碱各因素的影响顺序为D＞C＞A＞B，即乙醇浓度＞时间＞料液比＞温度，乙醇浓度影响尤为重要，由此说明超声提取白刺总生物碱时对乙醇浓度最为敏感，对其他因素敏感度较小。

表3 正交实验结果Table 3 Results of orthogonal experiments

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

2.4 静态吸附

通过7种大孔树脂对生物碱的静态吸附实验，根据所提供的公式进行计算，得到的各种型号树脂的吸附率及解析率如表4，可看出D101型号的树脂对生物碱的吸附率及解析率都是最高的，说明D101型号的大孔树脂相对其他几种树脂是最适合白刺的生物碱分离纯化的。

表5 不同型号树脂筛选结果Table 5 Screening results of different types of resin

2.5动态吸附

式（3）中：k保为保留率；k1为样品洗脱后总生物碱含量；k2为白刺中总生物碱的含量。

从表6可以看出，以生物碱保留率为考察指标，1号实验所得保留率最高，此时的工艺条件为上样液pH值为5，流速为0.75 mL/min，乙醇的洗脱浓度为80%。

表6 均匀设计实验结果Table 6 Experimental results of uniform design

3 讨 论

超声波提取西伯利亚白刺种籽中总生物碱时各因素对总生物碱提取量的影响次序是乙醇浓度＞时间＞料液比＞温度。最佳的提取工艺为料液比为1∶20，温度60℃，时间40 min，乙醇浓度70%。在此条件下提取白刺种籽中总生物碱的含量为 217.372 9 μg/g。

通过7种大孔树脂对生物碱的静态吸附及解析实验，得出D101对白刺总生物碱的吸附、解析效果最好，对其进行动态吸附，可知最佳的工艺条件为上样液pH值为5，流速为0.75 mL/min，乙醇的洗脱浓度为80%。

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Ultrasound extraction total alkaloids from Nitraria sibirica Pall and process research of macroporous resin purif i cation

WANG Yu-ling1, ZENG Hui-ming1, ZHANG Jian-qiu2, MA Ting-jun3
(1. Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2. Baicheng City Academy of Forestry, Baicheng 137000, Jilin, China; 3. College of Food Science, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

In order to optimize the extract condition, total alkaloids inNitraria sibiricawas extracted by ultrasound and the content of total alkaloids was determined by the acidic dye colorimetry, the effects of solid-liquid ratio, temperature, time and ethanol concentration on the optimum extraction parameters were investigated, thereby determining the optimal extraction parameters; the best one of isolation and purif i cation from seven kinds of resin were screened out to research its effects on the alkaloids of static, dynamic adsorption. The results show that with the conditions of solid-liquid ratio of 1:20, temperature 60 ℃, time 40 minutes, ethanol concentration of 70%, the highest total alkaloid extract rate was 217.372 9 μg/g; the adsorption and resolution effects of D101 onN. sibirica’s total alkaloids were the best, the dynamic adsorption tests proved that the optimum process conditions were: sample solution pH 5, fl ow rate 0.75mL/min,ethanol concentration 80%.

Nitraria sibiricaPall; ultrasound; alkaloid; macroporous resin

S789.3；S723.1

A

1673-923X(2013)01-0109-05

2012-10-10

863课题（2009VV10Z109）；北京市农产品加工及贮藏工程重点建设学科（PXM2009_014207_078172)

王玉玲（1987-），女，硕士研究生，从事植物资源的开发利用；E-mail:wangyuling64@163.com

曾会明，男，副教授，从事草坪草育种；E-mail:sciinfo@163.com

[本文编校：欧阳钦]