rAAV-hBMP7的包装纯化及感染滴度的测定※

2013-01-03 03:03西安交通大学口腔医院西安710004石建峰饶国洲
陕西医学杂志 2013年5期
关键词:滴度糖苷酶显微镜

西安交通大学口腔医院 (西安710004) 石建峰 饶国洲 魏 虹 张 晨 李 昂

骨形成蛋白(BMPs)是一类具有多种功能的生长因子,属于转化生长因子β超家族,具有明显促成骨作用的细胞因子,参与机体胚胎发育、骨骼形成及组织器官发生等生命过程。人骨形成蛋白7(Human bone morphogenetic protein-7,hBMP7)是其中促成骨作用较强的一个成员,具有较强的骨诱导能力及维持软骨细胞的表型、促进细胞外基质如蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成、促进有成骨作用的细胞分化等能力,在体内外均能诱导形成骨组织、牙本质,不仅可实现牙槽骨的再生,还可明显提高牙骨质再生量,是组织工程技术常用的一种细胞因子[1]。

基因转移载体的选择,决定着治疗基因能否进入种子细胞并实现有效表达,是基因治疗和组织工程技术的关键环节。重组腺相关病毒[2](Recombinant adeno-associated virus carrierr,rAAV)宿主范围广,既能感染分裂期细胞也能感染非分裂期细胞;能将其基因组DNA定点整合到宿主细胞染色体上,使携带的外源基因在宿主体内持续稳定表达,且不引起宿主基因突变。以rAAV为基础构建的病毒载体,已经在科学研究领域及多种疾病的基因治疗方面得到了广泛的应用。

本组拟利用前期构建并鉴定正确的腺相关病毒载体pAAVIRES-hrGFP-hBMP7[3],应用 AAV Helper-Free System、磷酸钙三质粒共沉淀法,在AAV-293细胞内包装具有感染性的腺相关病毒rAAV-hBMP7,按氯仿处理、PEG/NaCL沉淀的方法浓缩纯化;并测定其包装效率及感染AAV-HT1080细胞后的感染效率和滴度,为组织工程技术治疗牙周组织缺损做基础性研究。

材料与方法

1 试验材料 AAV Helper-Free System、AAV-293细胞、AAV-HT1080细胞、pAAV-GFP质粒、胎牛血清、L-DMEM 培养基、H-DMEM 培养基购自美国Stratagene公司;高纯度质粒大提试剂盒购自北京TIANGEN公司;磷酸钙法细胞转染试剂盒、β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒购自碧云天(Beyotime)公司;氨苄青霉素、链霉素购自北京奥科;其余试剂为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 质粒转化 制备含 Amp(50μg/m1)的LB固体平板,流水下快速解冻DH5α感受态细胞,加入1 μl pAAVIRES-hrGFP-hBMP7质粒,轻轻旋转混匀,冰浴30min;42℃热休克90s;冰浴2min,加入预热至37℃的LB液体培养基400μl,37℃,摇床转速<50r/min温育45min,使细胞复苏并表达质粒编码的抗性基因;取100μl菌液涂于含X-gal和IPTG的琼脂平皿,于37℃培养16~18h;终止培养后,将平板置4℃冰箱1~4h,使蓝白斑筛选实验充分显色。同法对辅助质粒pAAV-Helper和包装质粒pAAV-RC进行转化。

2.2 质粒大量提取及浓度和纯度测定 每种质粒随机挑取3个转化阳性克隆(白色克隆),各加入到5 ml LB液体培养基中(含 Amp 50μg/ml),37℃、225 r/min震荡培养3h,分别加入到装有250ml LB液体培养基(含 Amp 50μg/ml)的500ml三角烧瓶中,37℃、225r/min震荡培养过夜,测A600处OD值>0.60,质粒大提试剂盒提取质粒,进行浓度和纯度测定。用BamHI/SalI双酶切鉴定重组病毒质粒pAAVIRES-hrGFP-hBMP7。

2.3 AAV-293细胞培养 在37℃水浴中快速解冻AAV-293细胞,将细胞悬液转移到装有10mlDMEM培养液的锥底离心管中,室温下以200g的速度离心3min吸除上清液,重新加入5ml新鲜DMEM轻轻吹打重悬细胞,转移到一个装有10mlDMEM(氨苄青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml)的75cm的组织培养瓶中,37℃、5%CO2条件下培养。细胞生长至50%融合时传代培养。

2.4 三质粒共沉淀法AAV-293细胞包装rAAV-hBMP7 将AAV-293细胞种植于6孔培养板内,3×105/孔,培养至70~80%融合。采用AAV Helper-Free System/磷酸钙三质粒共沉淀法转染AAV-293细胞(以下为每孔加液量)。转染前30~60min,吸去培养液,加入新鲜的不含抗生素的DMEM完全培养液4ml。分别取纯度1.80以上的pAAV-Helper、pAAVIRES-hrGFP-hBMP7 和 pAAV-RC 各 10μl(1μg/μl),加入到 100μl氯化钙溶液中混匀,对照组以pAAV-GFP代替病毒质粒。把DNA-氯化钙溶液加入到100μl BBS溶液中混匀,室温孵育20min均匀滴加到整个孔内。实验组10孔,对照组1孔,阴性对照1孔/板。37℃,5%CO2的培养箱中培养。12h后轻轻晃动培养板数次,吸去含磷酸钙沉淀的培养液,加入2ml新鲜的完全培养液继续培养72h,收集细胞,期间倒置显微镜下观察细胞形态及荧光表达情况。

病毒包装完成后,取平行对照rAAV-GFP组细胞培养皿,倒置荧光显微镜下随机选取高倍视野下(400×)10个视野,计数视野内表达荧光细胞数量及细胞总数计算rAAV-hBMP7的包装效率。

2.5 病毒液的收集和纯化 用细胞刮刀把贴壁细胞全部刮落到培养液中,转移到一消毒、预冷的50ml离心管中,反复冻融四次(干冰浴和37℃水浴),每次冻和融的时间为10min左右。每次融化后轻轻漩涡振荡离心管。12000r/min离心10min除去细胞碎片。将含病毒的上清转入一新的试管中。

向病毒液中(40ml)加入1/10体积的氯仿,37℃,300rpm/min剧烈振摇1h。加入固体氯化钠2.56g至终浓度为1mol/L,4℃、12000r/min离心30min,收集上清于一新的50ml离心管中,加入PEG8000 4.5g至终浓度10%,剧烈振摇直至完全溶解,冰浴1h。4℃,12000r/min离心30min弃上清,4ml PBS溶解沉淀,以每份0.5ml分装在1.5ml EP管中,–80℃保存。命名为rAAV hBMP7。

2.6 rAAV hBMP7感染 AAV-HT1080细胞将AAV-HT1080细胞复苏及传代培养(方法和步骤同AAV-293细胞的复苏与传代)。用L-DMEM调节细胞密度为1.5×105/ml,种植于12孔培养板,每孔1ml,37℃培养至70%融合。每孔加0.2ml AAV Permissive Growth Medium,(保留最初的培养液),漩涡振荡混合细胞,37℃孵育5~6h 吸除孔内液体,用37℃预温的L-DMEM 洗涤细胞1次。用L-DMEM将纯化的病毒原液0.1ml按10×的浓度梯度稀释为10-2,10-3,10-4,10-5,10-6。分别加入各培养孔,每浓度组设3孔,每孔0.5ml,在37℃孵育培养板2h,其间每30min轻轻漩涡振荡培养板几次。各加0.5ml预温的H-DMEM,继续培养48h。期间倒置显微镜和荧光显微镜下观察细胞形态结构及荧光表达情况。

2.7 β-半乳糖苷酶染色法测定rAAV hBMP7感染效率和滴度 AAV-HT1080细胞培养至48h,吸出培养液,用L-DMEM洗涤细胞一次,原位β-半乳糖苷酶染色试剂盒固定并染色细胞。每孔加0.5mlβ-半乳糖苷酶染色固定液,室温固定10min;吸除固定液,用PBS洗涤细胞3次,每次3min;每孔加入0.5ml染色工作液(10μlβ-半乳糖苷酶染色液 A +10μlβ-半乳糖苷酶染色液B+930μlβ-半乳糖苷酶染色液C+X-Gal溶液50μl);37℃孵育20min至2h,直至部分细胞颜色变蓝。显微镜下观察并计数一定细胞中蓝色细胞的个数,计算rAAV hBMP7感染效率,感染效率=染色阳性细胞数/计数细胞总数×100%,并估算病毒原液感染滴度。

结 果

1 质粒浓度和纯度 提取的pAAVIRES-hrGFP-hBMP7质粒,经紫外分光光度仪检测,在260nm处OD值为0.56,OD260/OD280=1.79;OD260值为1.0相当于大约50μg/ml双链DNA,质粒稀释倍数为40,计算得质粒浓度为1.12mg/ml(1.12μg/μl)。同法计算包装质粒pAAV-RC的浓度为1.08μg/μl,纯度为1.81;辅助质粒pAAV-Helper浓度为1.22μg/μl,纯度为1.82,纯度和浓度均符合后继实验要求。

2 pAAVIRES-hrGFP-hBMP7双 酶切 鉴 定 用BamHI/SalI双酶切重组病毒质粒pAAVIRES-hrG FP-hBMP71.2%琼脂糖凝胶电泳图谱显示6100bp和1300bp区域有两条DNA条带(见图1),与病毒载体 质 粒 pAAVIRES-hrGFP(6.1Kb)及 目 的 基 因hBMP7(1296bp)大小一致。双酶切图谱说明所提质粒为前期构建并鉴定的质粒pAAVIRES-hrGFP-hBMP7。

3 rAAV hBMP7在293细胞内的包装

3.1 包装6h细胞形态结构和荧光表达情况 病毒包装6h后,倒置显微镜低倍下观察可见rAAVGFP组、rAAV-hBMP7组AAV-293细胞形态正常、生长状态良好。提示磷酸钙共沉淀物对AAV-293细胞生长干扰较小,底部可见少量细小的颗粒,为残余的磷酸钙共沉淀物;高倍镜下观察AAV-293可见细胞浆中含有较多极细小的磷酸钙颗粒(见图2)。倒置荧光显微镜观察,阴性组无荧光,rAAV-GFP组和rAAV-hBMP7组均出现荧光表达,以对照rAAV-GFP组为明显(见图3)。提示病毒在293细胞内已经获得“拯救”、包装,并随细胞的分裂而复制,报告基因也已经开始表达。

图1 质粒pAAVIRES-hrGFP-hBMP7双酶切图M:DNA MakerⅥ,1:BamHI/SalI 双酶切

图2 包装6h后AAV-GFP组倒置显微镜下AAV-293细胞表型变化(A:100×;B:400×)

图3 包装12h后AAV-GFP组荧光表达(A:普通倒置显微镜;B:倒置荧光显微镜;400×)

3.2 包装72h观察 阴性组始终无荧光发出(图4A,D),随培养时间延长,rAAV-GFP组(见图4 B,E)和rAAV-hBMP7(见图4C,F)组培养基颜色逐渐变为棕黄色,板底细胞表面有沉淀物形成,上清中也有大量絮状物出现,细胞形态变的不规则,有相互融合的趋势。两组细胞表达荧光的细胞数量及荧光强度也随包装时间延长而增加,72h时绝大多数细胞都发荧光。各组细胞同一视野下形态结构及荧光表达情况见图4。

3.3 包装效率 病毒包装完成后,取平行对照rAAV-GFP组细胞培养皿,倒置荧光显微镜下随机选取高倍视野下(400×)10个视野,计数视野内表达荧光细胞数量及细胞总数,取平均值计算rAAV-hBMP7包装效率为94.16±0.13%。

图4 包装72h倒置显微镜下AAV-293细胞表型变化及倒置荧光显微镜下GFP表达

4 rAAV-hBMP7感染AAV-HT1080细胞荧光表达 纯化的rAAV-hBMP7各浓度组感染AAVHT1080细胞后,12h左右均有表达绿色荧光的细胞出现。随着培养时间的延长,高浓度组细胞从培养板底面脱离,细胞结构破坏,相互融合,荧光表达也融合成片,继续培养则荧光表达下降;低浓度组细胞界限清晰,结构较正常,细胞损伤轻微,荧光表达清晰持久(见图5),6~7d达到高峰。

5 原位β-半乳糖苷酶染色法测定rAAV hBMP7感染效率和病毒滴度 rAAV-hBMP7转染易感细胞AAV-HT1080后,病毒复制,病毒载体上的β-半乳糖苷酶基因表达,催化底物X-Gal显色,细胞被蓝染。选择细胞形态保持较完整、数量适中(10<n<100)的浓度组,光学显微镜下计数10不同视野中的蓝染细胞数,计算转染效率:镜下观察发现10-5,10-6两个组细胞形态完整(见图6A),界限清晰;其他组别细胞形态损伤严重,细胞边缘模糊、破裂相互融合(见图6B),提示病毒颗粒过多,细胞发生毒性改变。计算转染效率10-5组约为78%;10-6组约为35%。参照细胞形态变化情况可以确定,实验获得的rAAV-hBMP7作10-5稀释可以获得78%的较好转染效率;以该组别转染效率推算病毒感染滴度:种植细胞数/ml×感染效率×病毒实际稀释倍数(1/稀释用量0.1ml÷稀释后浓度值10-5÷每孔病毒用量0.5ml),rAAV hBMP7的滴度约为2.34×1011v·g/ml,可用于后继实验。

图5 rAAV-hBMP7(10-5 组)感染 AAV-HT1080细胞72h后荧光表达(A:倒置显微镜;B:倒置荧光显微镜;×100)

图6 原位β-半乳糖苷酶染色结果(200×)

讨 论

骨形成蛋白(BMPs)存在于骨、牙本质等多种组织中,对骨组织的发育和修复重建起着关键性作用,BMP7是BMPs家族中促成骨能力最强的生长因子之一[4]。研究发现BMP7诱导新骨形成,一般是通过三步多分子级联放大反应来产生成骨效应[5]。①诱导细胞趋化,促进特定的细胞群发生方向性趋化,进而诱导细胞黏附和增殖;②诱导和促进有丝分裂;③诱导细胞分化,BMP-7能够诱导多种细胞向成骨型细胞分化,促进细胞基质合成,I型、II型胶原、ALP、骨钙素等的基因表达升高。

在口腔领域,许多学者尝试将BMP7或BMP7复合其它因子用于牙周组织工程中,刺激牙周膜中的潜在细胞群分化增殖,促进牙周和颌面部组织缺损的修复与重建。Jin等[6]利用BMP-7基因修饰的皮肤成纤维细胞,附合凝胶载体支架,修复小鼠下颌牙槽骨缺损的实验发现,转染组小鼠在骨缺损部位有软骨的快速形成,继而形成骨及牙骨质。Yeh[7]等的研究发现,BMP7能促进分化的成骨细胞高表达骨钙素及碱性磷酸酶,诱导形成钙化结节,细胞成骨活性增强。证实了rhBMP-7的促成骨特性。本课题应用前期构建并鉴定的pAAVIRES-hrGFP-hBMP7质粒,制备有感染性的rAAV病毒,以期获得hBMP7在真核细胞内的表达,为牙周组织缺损的治疗做基础性研究。

腺相关病毒载体具有能在人类染色体定点整合、长期稳定表达而无致癌隐患,转染效率高而免疫原性低等优点,是近年来研究和应用最广的一种病毒类载体[8]。Kunze等[9]比较了1~5型AAV 对牙周膜细胞、牙龈细胞感染效率的差别后发现,各型的转染效率存在差别,以AAV2最高,AAV4最低,其它三型介于这俩型之间。rAAV病毒的包装,主要涉及包装容量、包装体系和病毒纯化几个方面。包装容量小是rAAV载体最大的缺陷,仅为5kb左右,很多情况下不能满足基因治疗的需要,如何增加rAAV载体的包装容量成为扩大其应用的热点课题[10]。本组采用的pAAVIRES-hrGFP质粒,仅保留了AAV包装和整合不可缺少的ITRs,不仅增加了包装容量,在两个ITRs之间还有一核糖体基因IRES,可以实现双基因共表达,又能促使AAV的核内定位。

rAAV传统的包装体系不仅步骤繁琐,而且存在AV的污染难以完全去除。本组采用的AAV Helper-Free System,就是对其不断改造的基础上建立的比较完善的包装体系[11]。其中的pAAV-RC表达AAVCap和Rep蛋白;pHelper含有与AAV包装有关的腺病毒基因E4、E2a和VA RNA;E1a和E1b则由293包装细胞提供;该系统不仅简化了操作、提高了产量,而且避免了野生型AAV和AV的污染。本实验应用该系统包装6h时,各组都出现荧光表达,说明该系统病毒“拯救”很快,而且细胞形态正常、生长状态良好。

病毒纯化的目的是去除可能的AV和野生型AAV污染,及可复制性AAV(rcAAV)杂质(含有非目的基因DNA序列的类AAV颗粒)[12]。传统的方法是硫酸铵浓缩、氯化铯密度梯度离心,操作繁琐,病毒液损失太多[13]。近年来,吴小兵等[14]提出的氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿反复抽提的方法,对rAAV病毒原液进行浓缩和纯化,效果较为满意。

病毒感染效率和滴度的测定,许多研究者[15]应用AAV易感细胞(HT1080)表达荧光的细胞数(或百分比)来进行估算,简便易行,但是计数结果容易受培养基底色和荧光折射的影响,估算结果有较大偏差。本组采用原位β-半乳糖苷酶染色,计数蓝染细胞个数,细胞间干扰小,而且能观察病毒颗粒对细胞形态的影响情况。

本组应用磷酸钙三质粒共沉淀法,成功制备了rAAV-hBMP7,通过对照组AAV-GFP表达荧光的细胞数量,测定包装效率为94.16±0.13%。原位β-半乳糖苷酶染色估算rAAVhBMP7病毒原液的感染滴度为2.34×1011v.g/ml。可用于后继实验的细胞转染。

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