HPLC－MS/MS测定猪肉和猪肝中氯霉素残留量的研究

刘吉成

（广西玉林食品药品检验所，广西 玉林 537000）

HPLC－MS/MS测定猪肉和猪肝中氯霉素残留量的研究

刘吉成

（广西玉林食品药品检验所，广西 玉林 537000）

建立高效液相色谱－串联质谱法（HPLC－MS/MS）检测猪肉和猪肝中氯霉素药物残留的分析方法。样品经4%的氯化钠溶液和乙腈提取并沉淀蛋白质，正己烷脱脂净化，乙酸乙酯液液萃取，再浓缩定容，上HPLC－MS/MS仪器，用Syncronis C18柱分离，以乙腈－水（40∶60）作为流动相，采用电喷雾离子源（ESI），负离子模式，多反应监测（MRM）方式检测，用氯霉素－D5作内标物来定量。在该试验条件下，氯霉素在1～15ng/mL浓度呈良好的线性关系，r＝0.999 2，最低检出浓度为0.1μg/kg，样品的加样回收率在90.0%～110.0%，重复性好RSD＜3.0%。该方法能对猪肉和猪肝中氯霉素残留进行定性及定量分析，方法精密度较好、准确度较高、选择性好，结果满意。

高效液相色谱－串联质谱；氯霉素；猪肉；猪肝；残留

氯霉素是一种酰胺醇类抗生素，可用于各种革兰氏阴性细菌疾病的治疗，曾被大量应用于畜禽及水产养殖业中，但滥用会导致再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏等不良反应［1］。许多国家都禁止在食用性动物饲养和治疗中使用氯霉素，即最大残留限量（MRL）为0mg/kg，中国农业部193号公告中将氯霉素作为一种禁用物质［2］。

目前国内外常用免疫法和化学分析检测法测定氯霉素残留。粗筛方法有酶联免疫法（ELISA）、微生物法和生物传感器法，确证方法有：液相色谱、气相色谱、气相色谱－质谱联用和液相色谱－质谱联用等方法［1］。液质联用方法是首选的最佳检测手段，具有检出限低、重现性好以及假阳性少等优点。

有报道［3－5］用 HPLC、GC－MS和 HPLC－MS/MS测定猪肉中氯霉素的含量，结果发现HPLC测定氯霉素灵敏度相对低；用GC－MS测定氯霉素残留，氯霉素必须衍生化后才能测定，操作复杂。本试验采用HPLC－MS/MS测定猪肉和猪肝中氯霉素残留，直接用对照品加到空白基质中做标准曲线，采用液液萃取进行提取和纯化，内标法定量，实现了消除基质效应，定量准确的效果。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器

高效液相－质谱联用仪（配 MassLy4.1数据处理软件）：Waters2695－Quattro MicroTMAPI，美国 Waters公司；

氮气发生器：LC/MS20－1，英国Domnick hunter公司；

高速冷冻离心机：K280R，英国Centurion（森特恩）公司；

旋转蒸发器：Hei－VAPA 德国Heidolph公司；

氮吹仪：N－EVAPTM－112，美国 Organomation Associates公司；

电子分析天平：XS－205DU，美国 Mettler Toledo公司。

1.1.2 标准物质和试剂

乙腈、正己烷：色谱纯，美国Fisher Scientific公司；

试验用水：超纯水，自制；

氯化钠、乙酸乙酯等：分析纯，广东光华化学厂有限公司；

氯霉素对照品：含量99.5%，批号130555－200501，中国生物制品检定所；

氯霉 素－D5：100ng/μL，德 国 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 对照品和内标溶液的配制

1.2.1 对照品溶液的配制 取氯霉素对照品10.73mg，置100mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，再精密量取1mL置100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀作为对照品储备液。

1.2.2 内标溶液的配制 精密量取氯霉素－D5（100ng/μL）1mL置100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度即得内标工作液（浓度为1μg/mL）。

1.3 样品处理

1.3.1 样品制备 猪肉去皮后绞碎，猪肝直接绞碎，分别装入包装袋，－20℃保存。

1.3.2 样品提取 取测试样品约5g，置50mL离心管中，加1μg/mL氯霉素－D5内标工作液10μL，加乙腈5mL，4%氯化钠 溶 液［6，7］5mL，涡旋振荡 2min，6000r/min 离 心10min，取上清液至另一50mL离心管中，重复提取一次，合并提取液。提取液中加乙腈饱和的正己烷5mL，涡旋振荡1min，6 000r/min离心5min，弃去上层液（油脂多时可以多净化几次），加水饱和乙酸乙酯溶液5mL，涡旋振荡1min，6 000r/min离心5min，将上层液转移到100mL平底烧瓶中，重复提取3次，合并提取液，在40℃水浴减压浓缩至约0.5mL，用氮气吹至近干，残渣加乙腈－水（40∶60）1.00 mL超声溶解，摇匀，用微孔滤膜（0.22μm）滤过，取续滤液，即得。

1.4 色谱条件和质谱条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱：SyncronisC18，粒径5μm，150×2.1mm；柱温：35℃；进样量20μL；流动相：乙腈－水（40∶60）；流速：0.25mL/min。

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），负离子模式，采集方式为多反应监测（MRM）；毛细管电压为2.8kV；离子源温度为120℃；脱溶剂气温度为350℃，脱溶剂气氮气流速为750L/h；锥孔氮气流速为100L/h［8，9］；碰撞气为氩气；定性离子对、定量离子对、锥孔电压及碰撞能量见表1。

表1 氯霉素和氯霉素－D5的质谱参数Table 1 The parameters of chloramphenicol and chloramphenicol－D5in MS

2 结果与分析

2.1 线性关系

取5份空白基质，将对照品储备液加到空白基质中，再在每个浓度中加入氯霉素－D5储备液（1μg/mL）10μL，按1.3.2进行处理得到浓度分别为 1.0，5.0，8.0，10.0，15.0ng/mL的标准系列，氯霉素－D5浓度为10ng/mL。按1.4的条件测定，按照内标法计算得到曲线方程：

式中：

Y——响应值（对照品峰面积×内标物浓度/内标物峰面积），ng/mL；

X——对照品浓度，ng/mL。

内标物的RSD为3.3%。标准曲线图见图1，对照品中各个离子和总离子流图色谱图分别见图2和图3。

图1 氯霉素标准曲线图Figure 1 The standard curve of chloramphenicol

2.2 准确度和精密度试验

分别取空白的样品基质猪肉和猪肝约5g，添加不同浓度的氯霉素，用内标法做加样回收试验，测定的数据见表2和表3。

由表2和表3可知，样品回收率都在90%～110%，相对偏差都少于3.0%，说明该方法对猪肉和猪肝等样品含有氯霉素测定均有较好的准确度和精密度。

2.3 检出限

根据限量要求，对猪肉和猪肝加标回收试验，当添加浓度为0.1μg/kg时，定量离子信噪比S/N＝3.1，试验结果表明氯霉素的检出限为0.1μg/kg。

图2 对照品溶液MRM色谱图Figure 2 MRM chromatogram of standard solution

图3 阳性猪肉样品MRM色谱图Figure 3 MRM chromatogram of positive Pork sample

2.4 样品的测定

在市场上畜禽类共抽样160批，其中猪肉128批，猪肝32批，其中猪肉检出有氯霉素的有8批，猪肝0批，其浓度均在2～50μg/kg。

表2 猪肉样品加样回收的数据Table 2 Sample recovery results of pork

表3 猪肝样品加样回收的数据Table 3 Sample recovery results of pig liver

3 讨论

（1）在选择流动相时，曾尝试用乙酸胺加0.1%甲酸做水相，发现对照品均不出峰，而以纯水作水相时有峰出现。这可能是离子的存在干扰了化合物的电离。在选择有机相的时候，采用甲醇和乙腈均可行，但使用乙腈其灵敏度稍高，所以以乙腈和水作为流动相。

（2）在样品提取的过程中，仅用乙腈提取的时提取物的油脂含量较高，净化较为困难，但加入4%NaCl溶液以后，可有效降低提取物的油脂含量。

（3）在配制标准曲线的过程中，加基质的对照品的峰面积和不加基质的相差比较大，说明基质效应强，所以选择对照品加到空白基质中来配制标准曲线，可以消除基质效应带来的偏差。

4 结论

本试验建立的高效液相色谱－串联质谱法检测畜禽类中猪肉和猪肝氯霉素残留，采用乙腈和4%NaCl溶液提取样品中氯霉素成分，并同时沉淀样品中的蛋白质，用正己烷除掉油脂性成分，再用乙酸乙酯萃取，浓缩，内标法定量，并用空白基质加对照品做标准曲线。本方法准确可靠，重现性好。与其他检测方法相比，在前处理上易于操作，减少了基质效应，检验成本低，适用范围广，灵敏度高，重现性好，准确可靠，选择性好，可用于畜禽类氯霉素残留的检验方法。

1 任佳，郑小平，黄菲菲，等.UPLC－MS/MS法测定乳制品中氯霉素类药物［J］.食品与机械，2011，27（4）：75～78.

2 刘正才，杨方，余孔捷，等.兽药粉中氯霉素类和硝基呋喃类药物的液相色谱－串联质谱分析方法的研究［J］.中国兽药杂志，2011，45（9）：40～43.

3 李海平，张树海，张坤生.GC－MS分析法在猪肉氯霉素残留检测中的应用［J］.食品与机械，2006，22（5）：89～92.

4 农以宁，蔡江帆，蒙肇云，等.SPE－HPLC法同时测定猪肉中常见的抗生素和克仑特罗的研究［J］.桂林电子科技大学学报，2009，29（5）：406～409.

5 杨总，李秀琴，王娟，等.同位素稀释液相色谱－串联质谱法准确测定猪肉中的氯霉素残留［J］.色谱，2011，29（9）：927～931.

6 中国国家标准化管理委员会.GB/T22338——2008动物源性食品中氯霉素类药物残留的残留测定［S］.北京：中国标准出版社，2008.

7 李丽莉，罗轶.液相色谱－串联质谱测定鸡肉中氯霉素残留［J］.中国卫生检验杂志，2011，21（6）：1 357～1 358.

8 张立坚，张俊杰，张良滔，等.液相色谱－质谱法检测渔业养殖水中硝基呋喃及氯霉素药物［J］.质谱学报，2011，32（4）：207～210.

9 陈君义，孙慧宇，舒永兰，等.同位素内标液相色谱－串联质谱法测定动物源性食品中氯霉素残留［J］.化学分析计量，2011，20（2）：46～48.

Determination of chloramphenicol residues in pork and pig liver by LC－MS/MS

LIU Ji－cheng

（YuLin Institute for Food and Drug Control，Yulin，Guangxi537000，China）

A method of determination of chloramphenicol in pork and pork liver by High Liquid chromatography－Tandem Mass Spectrometry（HPLC－MS/MS）was developed.Samples were extracted with acetonitrile and 4%sodium chloride solution，and precipitation protein at the same time，defatted by hexane，and Ethyl acetate liquidliquid extraction，then concentrated and constanted volume.Samples were detected by LC－MS/MS and isolated with Syncronis C18and the liquid phase was acetonitrile and water（40∶60），The electrospray ionization（ESI）mass spectrometry was run in negative ion multiple reaction monitoring mode，taking the chloramphenicol－D5as internal standard.At these experimental conditions，chloramphenicol had a good liner relatively（r＝0.999 2）between 1～15ng/mL.recovery rate of samples ranged from 90.0%～110.0%，with LOD of 0.1μg/kg，and replicability was RSD＜3.0%.This method could detect the chloramphenicol residue in pork and pork liver，and with a better precision，higher accuracy，better specificity，and the result was satisfied.

HPLC－MS/MS；chloramphenicol；pork；pig liver；residues

10.3969 /j.issn.1003－5788.2012.04.025

刘吉成（1982－），男，广西玉林食品药品检验所主管药师，硕士。E－mail：liujichenggood＠126.com

2012－01－22