产胞外多糖菌的鉴定及多糖性质研究

田文祥蹇华丽杨幼慧廖美德

（1.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；2.广东一方制药有限公司，广东 佛山 528244；3.华南农业大学资源与环境学院，广东 广州 510642）

产胞外多糖菌的鉴定及多糖性质研究

田文祥1，2蹇华丽1杨幼慧1廖美德3

（1.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；2.广东一方制药有限公司，广东 佛山 528244；3.华南农业大学资源与环境学院，广东 广州 510642）

从华南农业大学杀虫植物园土壤中筛选出一株胞外多糖高产菌株PS04，根据形态学、生理生化特征以及16S r DNA核酸序列分析结果表明，该菌属于多粘类芽孢杆菌。采用察氏培养基，pH6.0，于37℃摇瓶培养48 h，多糖产量为13.3 g／L。对其多糖性质研究表明，该多糖的性质与黄原胶类似，具有低浓度下高黏性、假塑性、耐盐性，同时对热及酸碱有较好的稳定性。

多粘类芽孢杆菌；胞外多糖；16S rDNA；鉴定；黏度性质

微生物胞外多糖是指微生物在生长代谢活动中分泌到细胞壁外的多糖或多糖混合物。与植物多糖相比，微生物多糖的化学结构更加复杂，这也使其拥有更加特殊的性质，因此微生物多糖被作为增稠剂［1］、稳定剂［2，3］、乳化剂［4］或凝胶剂［5］广泛应用于食品行业。另外，在一些新的研究领域中微生物多糖也作为生物絮凝剂［6］、重金属离子吸附剂［7］和生物活性物质［8］被开发应用。

本试验从华南农业大学杀虫植物园土壤中分离筛选得到一株在其生长过程中可以分泌大量黏性多糖的菌株PS04，通过形态观察、生理生化试验和16S r DNA序列分析对其进行鉴定，并对其多糖黏度性质进行初步研究，为一种新型多糖生产菌株的开发应用提供基础数据及参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

菌株PS04：从华南农业大学杀虫植物园土壤中分离得到，接种于察氏斜面培养基，在30℃培养48 h后保存。

1.2 试剂与仪器

黄原胶：广州天冠食品配料有限公司；

NaCl、KCl、CaCl2·2 H2O、MgSO4·7 H2O、ZnSO4·7 H2O、FeSO4·7H2O等：均为分析纯试剂；

黏度计：LVDV－Ⅱ＋RPO，美国Brookfield公司。

1.3 菌种鉴定

1.3.1 形态学及生理生化特性 参考伯杰细菌鉴定手册［9］、常见细菌系统鉴定手册［10］与芽孢杆菌属［11］，对菌株的菌体及菌落形态和生理生化特征进行鉴定。

1.3.2 16S r DNA基因序列测定 PCR扩增引物［12］，F：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′； R：5′－AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3′。以PS04菌株总DNA为模板，扩增目的片段。扩增程序：94℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，40 s，72℃，100 s，30个循环；72℃，10 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，交由上海英骏生物技术有限公司测序。

1.3.3 序列分析 根据测序结果，在NCBI上通过BLAST比对，从GenBank中搜索相关种的公认16S rDNA标准序列数据，用Clustal X 1.8进行多序列比对分析，利用 MEGA 4.1的Neighbor－joining法构建系统发育树。

1.4 液体发酵培养基及流程

1.4.1 培养基 斜面、种子、发酵培养基均采用察氏培养基 ，p H 6.0。

1.4.2 发酵流程

培养过程中每6 h采用干重法测定经提取纯化的多糖含量；培养48 h，将所有培养液中多糖提取纯化［13］，冷冻干燥后进行黏度性质测定。

1.4.3 干重法测定多糖含量 测定步骤：① 取锡箔纸，折成凹状，编号，于105℃烘2 h至恒重，用镊子夹取入干燥器，待冷却后于分析天平上称重 （W1），精确到小数后4位。② 取2 m L发酵液加入2倍体积的95%乙醇，入10 m L离心管，充分混匀4℃下静置30 min。③4 000 r／min下离心15 min，去除上清。加入5 m L乙醇静置10 min，同条件下离心，去上清。④将离心管中沉淀用镊子轻轻夹起放入准备好的锡箔纸中，105℃下在烘箱中烘至恒重，放入干燥器冷却，带室温，称重（W2），精确到小数点后4位。W2与W1的差值即为多糖重量。

1.5 多糖的黏度性质及影响因素

1.5.1 多糖溶液制备 精密称取定量多糖粉末，溶于去离子水中，搅拌均匀，于4℃下溶胀过夜，恢复至室温待测。

1.5.2 转速回环试验 按照方法1.5.1配制浓度为0.5%的多糖溶液。利用黏度计控制软件RHEOCALC编辑程序，设制转速从5 r／min连续增加到100 r／min，之后立即连续降低至5 r／min，用4号转子于室温下测定黏度的变化值。

1.5.3 多糖浓度与溶液黏度的关系 按照1.5.1配制不同浓度的多糖及黄原胶溶液。设定转速为250 r／min，用4号转子于室温下测定溶液黏度。

1.5.4 温度变化对多糖溶液黏度的影响 按照1.5.1配制浓度为0.5%与1.0%的多糖及黄原胶溶液。采用5号转子，转速250 r／min，测定不同温度下多糖及黄原胶溶液的黏度。

1.5.5 p H值对多糖溶液黏度的影响 按照1.5.1配制浓度为0.5%的多糖及黄原胶溶液。用HCl或NaOH溶液调节p H值，设定转速为250 r／min，用4号转子于室温下测定不同p H值时溶液的黏度值。

1.5.6 不同金属离子对多糖溶液黏度的影响 按照1.5.1配制多糖溶液，精密称取药品，溶于去离子水，搅拌均匀，与多糖溶液混合（多糖溶液终浓度为0.3%，金属离子浓度为0.1 mol／L），搅拌均匀并静置4～6 h，使溶液充分平衡。设定转速为250 r／min，用3号转子于室温下测定溶液的黏度。

2 结果与讨论

2.1 菌株PS04菌落、菌体形态和生理生化鉴定

PS04菌株在培养基中培养24 h后，形成3 mm左右菌落，菌落呈圆形，隆起，表面光滑，边缘整齐，湿润，呈白色透明状。经光学显微镜观察菌株细胞呈杆状，宽度0.6～0.8μm，长度2～4μm。革兰氏染色均匀，且为阳性，产生芽孢。其生理生化鉴定见表1，与多粘类芽孢杆菌（paenibacillus polymyxa）符合。

表1 PS04菌株部分生理生化特征Table 1 Partly biochemical and physiological characteristics of the strain PS04

2.2 菌株PS04的16S r DNA鉴定

菌株PS04的PCR扩增产物电泳结果见图1。

图1 菌株PS04的PCR产物电泳图Figure 1 Electrophoresis pattern PCR product of PS04

菌株PS04的16S r DNA基因核苷酸序列全长为1 463 bp，将该序列提交Gene Bank进行Blast同源性序列分析，结果发现，亲缘关系相近的序列为类芽孢杆菌属，达到98%以上。利用MEGA 4.1的Neighbor－joining法构建系统发育树，经过1 000次随机抽样计算Bootstrap值，得到系统发育树见图2。结果表明该菌株与Paenibacillus polymyxaWY110达到98%以上的同源性。结合形态学与生理生化特征综合比较，可以确定菌株PS04在分类学地位上是归属于多粘类芽孢杆菌（paenibacillus polymyxa）。

图2 基于16S rDNA构建的菌株PS04系统发育树Figure 2 Phylogenetic tree based on the polygenetic analysis of 16S rDNA sequences showing the position of strain PS04

2.3 发酵产物

按1.4.2发酵流程得到发酵产物为PS04粗多糖（13.3 g／L），白色粉末状物质，溶水后形成黏性溶液。该溶液加热并冷却至室温不形成凝胶。

2.4 多糖的黏度性质及其影响因素

2.4.1 PS04多糖溶液的剪切稀释性能 黄原胶溶液随着剪切速率增加，黏度下降，该现象表明PS04多糖溶液为典型的假塑性流体［14］。PS04多糖溶液在一定的浓度及转速下，黏度不随时间变化而变化，因此PS04多糖溶液不属于触变性流体。通过试验发现，PS04多糖溶液的黏度随着转速增加而降低，当转速达到35r／min，黏度下降速度平缓，表明PS04多糖溶液具有剪切稀释性能；当转速达到100 r／min后，随转速降低，溶液黏度逐渐增大（见图3）。该曲线以x＝100 r／min为对称轴，两边对称，这表明PS04多糖溶液黏度恢复无滞后性。

图3 转速对PS04多糖黏度的影响Figure 3 Effects of rotation speed on viscosity of PS04 polysaccharide solution

2.4.2 PS04多糖黏度与浓度的关系 由图4可知，PS04多糖溶液的黏度随浓度的增加而增大，当浓度较高时黏度增幅尤其显著。当PS04多糖浓度大于0.8%时，其黏度比相同条件下黄原胶黏度高，低浓度时则略低于黄原胶。与黄原胶类似，PS04多糖具有低浓度高黏度的特征，因此也具有良好的增稠性能。

图4 浓度对PS04多糖和黄原胶黏度的影响Figure 4 Effects of concentration on viscosity of PS04 polysaccharide and xanthan solution

2.4.3 温度对PS04多糖溶液黏度的影响 PS04多糖及黄原胶溶液的黏度随温度变化的结果见图5。由图5可知，1.0% 的多糖溶液在温度低于70℃的条件下，黏度变化不大；升温到90℃，黏度略有降低，从而表明PS04多糖溶液具有良好的耐温性。结果同时表明，在低浓度时，PS04多糖稳定性略低于黄原胶，而较高浓度则与黄原胶相当甚至比黄原胶更加稳定。

2.4.4 p H值对PS04多糖溶液黏度的影响 p H值的变化对PS04多糖溶液黏度的影响见图6。

图5 温度对PS04多糖和黄原胶黏度的影响Figure 5 Effects of tempertrue on viscosity of PS04 polysaccharide and xanthan solution

图6 p H对PS04多糖和黄原胶黏度的影响Figure 6 Effects of p H on viscosity of PS04 polysaccharide and xanthan solution

由图6可知，从p H 3.0到高碱性条件下，溶液黏度逐渐增加，但增加幅度不大。虽然与黄原胶相比，p H 3.0以上的酸碱性对PS04多糖溶液黏度影响相对较大，但仍可以看出，这种多糖具有较好的耐酸碱性。

2.4.5 金属离子对PS04多糖溶液黏度的影响 由图7可知，在测试浓度下（0.3%），离子对PS04多糖溶液的黏度影响不明显，表明该多糖具有良好的耐盐性。

图7 金属离子对PS04多糖黏度的影响Figure 7 Effect of different ions on viscosity of PS04

3 结论

结合菌体菌落形态学特征、生理生化特征以及16S rDNA核酸序列分析，菌株PS04属于多粘类芽孢杆菌。其发酵产生的PS04多糖具有黄原胶类似的性质，属于假塑性非牛顿型流体，具有低浓度高黏度的特征，因此具有良好的增稠性能。在不同的温度、p H值条件下，PS04多糖溶液稳定性好。添加不同种类金属离子对PS04多糖溶液（0.3%）的黏度影响不大。

黄原胶是应用最成功的微生物多糖之一，现已被广泛应用于食品、医药、印染、化妆品、石油开采等多个领域。PS04多糖在黏度性质方面与黄原胶较为相近，有些甚至优于黄原胶，而且PS04菌株具有极强高产多糖的潜力，通过进一步的研究，如果能降低生产成本，PS04多糖完全有可能在部分领域成为黄原胶的替代品或在其他领域有新的应用。

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Identification of an exopolysaccharide－producing bacteria and study on properties of polysaccharide

TIAN Wen－Xiang1，2JIAN Hua－l11YANG You－Hui1LIAO Mei－de3

（1.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong510642，China；2.Guangdong Yifang Pharmaceutical Co LTD，Foshan，Guangdong528244，China；3.College of Natural Resources and Environment，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong510642，China；）

Strain PS04 producing exopolysaccharide was isolated from the soil samples that were collected from the South China Agricultural U－niversity Botanic Insecticides Garden.It was identified as a Paenibacillus polymyxa by its morphological，the physiological and biochemical properties and 16S r DNA sequence analysis.Using Czapek’s medium，the exopolysaccharide production was up to 13.3 g／L by fermentation under the condition of temperature 37℃and p H 6.0.The properties of the polysaccharide were investigated.Like Xanthan Gum，this polysaccharide was distinguished by its high viscosity with low concentration，pseudoplasticity and salt－tolerance，at the same time，the polysaccharide was stable to heating，acid and alkali.

paenibacillus polymyxa；exopolysaccharide；16S r DNA；identification；viscosity property

田文祥（1986－），男，硕士。E－mail：zhongguotian1986＠163.com

杨幼慧

2011－11－01

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.01.043