益智仁对束缚应激致大鼠海马神经元NMDA受体亚基NR2B表达的调节作用

孙 莉，解 霞，刘 超，王 辉

（大连大学 医学院, 辽宁 大连 116622）

益智仁对束缚应激致大鼠海马神经元NMDA受体亚基NR2B表达的调节作用

孙 莉，解 霞，刘 超，王 辉

（大连大学 医学院, 辽宁 大连 116622）

为了研究益智仁对束缚应激致大鼠海马神经元NMDA受体亚基NR2B表达的调节作用，将30只SD大鼠随机等分为正常对照组、模型对照组和益智仁治疗组。模型对照组、益智仁治疗组大鼠每日束缚1次，连续3周。益智仁治疗组束缚前给予益智仁水提取物灌胃。采用免疫组织化学方法，观察益智仁水提取物对束缚应激大鼠海马神经元NMDA受体亚基NR2B表达的调节作用。结果显示NR2B阳性产物呈深棕色或棕褐色，主要沉积在CA1区和CA3区锥体细胞的细胞膜周边。与正常对照组比较，模型对照组的NR2B阳性产物明显增多（P＜0.01）；益智仁治疗组与模型对照组比较，NR2B阳性产物明显减少（P＜0.05）。实验结果提示益智仁能够降低束缚应激大鼠海马CA1区和CA3区NMDA受体亚基NR2B的表达。

益智仁；束缚应激；大鼠；海马；NR2B

随着时代的进步，竞争的激烈，长期慢性心理应激导致生理和心理上的异常，产生抑郁、焦虑和创伤后应激障碍等神经系统症状，引起各种身心疾病[1-3]，已被广泛关注。

海马是应激领域研究的一个重点，是应激损伤的重要靶区。应激性海马神经元损伤的重要原因之一是糖皮质激素诱导的谷氨酸和Ca2+依赖的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体的兴奋性作用。有研究显示：慢性复合应激对大鼠海马NMDA受体NR2A，NR2B亚基的表达增强[4]，慢性应激使大鼠海马NMDA受体NR2AmRNA，NR2BmRNA含量增加，且电针干预后NR2AmRNA、NR2BmRNA含量有明显降低等[5]。目前研究提示NMDA受体的变化是应激损伤海马神经元机制的一个环节，采取相应手段干预该环节可以缓解应激所致的损伤。

目前应激机制的研究较多，但抗应激药物的研究不多，曾有中药抗应激方面的研究报道[6,7]，但多停留在中药复方药效水平的研究上，天然资源中的单味中药的抗应激研究报道较少。益智仁是天然的单味中药，曾有抗衰老[8]、抗过敏性反应[9]等研究，但是抗应激作用方面的报道较少。曾有研究发现中药益智仁具有体外显著抑制谷氨酸兴奋毒性及诱发的神经细胞凋亡作用[10]，前期研究结果显示益智仁对慢性束缚应激大鼠海马神经元形态、结构损伤具有的调节作用[11]以及具有降低束缚应激致使大鼠海马神经元内Ca2+浓度升高的调节作用[12]。因此，本研究采用慢性束缚应激大鼠模型，试图从慢性束缚应激致大鼠海马神经元NMDA受体改变这一环节入手，研究益智仁对慢性束缚应激大鼠海马神经元NMDA受体NR2B亚基表达的调节作用，以探讨中药抗应激作用的机制，为中药在抗应激领域的临床应用奠定一定的理论基础，并为抗应激中药的研发开拓出一条新路。

1 对象与材料

1.1 实验动物及分组

健康SD大鼠30只，雌雄各半，体重180～220 g，随机等分为正常对照组、模型对照组、益智仁治疗组。模型对照组与益智仁治疗组大鼠每日束缚1次，每日开始时间及束缚时间不同，第1天为4 h，其后每次增加30～60 min，连续3周。束缚期间禁食水。模型对照组给予束缚制动刺激不给予益智仁灌胃，但束缚前给予等量蒸馏水灌胃；益智仁治疗组束缚前给予益智仁水提取物80 mg/kg体重灌胃；正常对照组不给任何刺激，但以等量蒸馏水灌胃。

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂：益智仁水提取物（大连大学医学院中医中药学系制备）；SABC免疫组化试剂盒（5%BSA封闭液，二抗羊抗兔，SABC溶液，武汉博士德公司）；DAB显色试剂盒（武汉博士德公司）；一抗(兔抗鼠)（武汉博士德公司）；4%多聚甲醛（天津市科密欧试剂有限公司）。

主要实验仪器：BX51TF型荧光显微镜（olympus）；全自动石蜡切片机(德国莱卡公司)。

2 方法

三组大鼠分别用10%水合氯醛0.35～0.40 g/kg体重腹腔注射麻醉，先后用冷生理盐水和4%多聚甲醛主动脉灌流固定，继之剥取脑块在4%多聚甲醛固定过夜，然后乙醇脱水，二甲苯渗透透明，石蜡包埋切片，片厚6μm。按SABC试剂盒说明书的步骤，进行免疫组织化学反应，反应步骤简述如下：切片置37℃烤箱2周后，常规脱蜡至水，热修复抗原，滴加5%BSA封闭液室温25 min，滴加兔抗鼠NR2B（1：300），4℃过夜,再滴加生物素化山羊抗兔抗体IgG室温35 min，滴加试剂SABC溶液30 min，DAB显色，苏木素轻度复染，1%盐酸酒精分化，酒精梯度脱水，二甲苯透明，封片，显微镜下观察。阴性对照组用一抗稀释液代替一抗，其余步骤同其他各组。

NR2B阳性细胞计数：每只大鼠选取相同部位的三张切片，每张切片分别在海马结构的CA1区和CA3区选取三个互不重叠的视野，200倍光镜下分别观察各组海马结构的CA1区和CA3区NR2B表达阳性细胞的变化，并运用图像分析软件测量各个视野NR2B阳性细胞的光密度值，计算每张切片的平均光密度值。

应用SPSS16.0统计软件，采用单因素方差分析进行组间比较，数据采用均数±标准差（±s）表示。P＜0.05 为有统计学意义，P＜0.01为有显著统计学意义。

3 结果

各组大鼠海马CA1区NMDA受体亚基NR2B的表达结果(见表1、图1)

表1 各组大鼠海马CA1区NMDA受体亚基NR2B阳性细胞光密度值比较

各组大鼠海马CA3区NMDA受体亚基NR2B的表达结果(见表2、图2)

表2 各组大鼠海马CA3区NMDA受体亚基NR2B阳性细胞光密度值比较

图1 各组大鼠海马CA1区NMDA受体亚基NR2B阳性细胞表达×200

图2 各组大鼠海马CA3区NMDA受体亚基NR2B阳性细胞表达×200

镜下观察，NR2B阳性产物颜色呈深棕色或棕褐色，主要沉积在CA1区和CA3区锥体细胞层的细胞膜。正常对照组大鼠的CA1区（图1a）和CA3区（图2a）锥体细胞排列整齐，细胞膜周边可见少量深染棕色颗粒状物质，胞质淡染；慢性束缚应激后，与正常对照组相比，可见CA1区（图1b）和CA3区（图2b）锥体细胞层的细胞排列紊乱，层数不清，细胞膜周边可见大量深棕色颗粒状物质，NR2B阳性产物明显增多（P＜0.01）；给予益智仁灌胃治疗后，可见CA1区（图1c）和CA3区（图2c）锥体细胞较模型对照组细胞排列较整齐，细胞膜周边仅见少量深棕色颗粒状物质，NR2B阳性产物明显减少（P＜0.05）。所有阴性对照组切片均无特异性着色。

上述实验结果表明：模型对照组与正常对照组比较，大鼠海马CA1区与CA3区NMDA受体亚基NR2B表达明显增多；益智仁治疗组与模型对照组比较，大鼠海马CA1区与CA3区NMDA受体亚基NR2B表达明显减少，但与正常对照组相比大鼠海马CA1区与CA3区NMDA受体亚基NR2B表达稍微增多。提示益智仁能够降低束缚应激大鼠海马CA1区与CA3区NMDA受体亚基NR2B的表达。

4 讨论

慢性束缚应激使动物产生焦虑、抑郁，进而引起神经系统病变，已被许多研究所证实。本实验采用慢性束缚应激动物模型，观察到大鼠海马神经元CA1区与CA3区NMDA受体亚基NR2B表达明显增多，并通过单味中药益智仁水提取物灌胃，发现益智仁对慢性束缚应激致大鼠海马神经元CA1区与CA3区NMDA受体亚基NR2B表达增多具有一定调节作用。

中枢神经系统中，海马是与认知行为功能密切相关的重要脑区,由于富含糖皮质激素（GC）受体，所以应激时，海马区极易选择性地受到高浓度GC的攻击[13]。应激性海马神经元损伤的重要原因之一可能是：应激使GC升高，GC与海马区GC受体结合，导致神经细胞外兴奋性氨基酸主要是谷氨酸含量增高[14,15]，激活细胞膜NMDA受体，促进细胞外钙离子内流，破坏神经元内Ca2+稳态平衡，造成神经元内Ca2+超载，胞内高Ca2+可激活内源性酶，产生大量的自由基毒害细胞，引起细胞坏死，也导致DNA链断裂，引发细胞凋亡[16-18]。所以，NMDA受体是应激引起神经元损伤的主要介导物质。

NMDA受体分为NR1、NR2和NR3亚基，其中NR2又由NR2A，NR2B，NR2C，NR2D亚基组成，NR1是受体通道复合体基本的功能亚单位，NR2是调节亚单位，其中NR2A和NR2B是分布于海马的主要调节亚单位，它们以多种方式构成完整的NMDA受体复合体，对其活性进行调节。位于突触的NMDA受体可起到保护细胞的作用，而突触以外的NMDA受体则激发细胞的毒性作用，促进细胞坏死和凋亡，其中NR2A亚基主要表达于突触，NR2B亚基主要表达于突触以外的部位如胞浆、轴突膜和树突膜等。所以，NR2A和NR2B分别被认为是神经元保护因子和神经元坏死因子。因此本研究采用免疫组织化学反应方法，研究益智仁对慢性束缚应激大鼠海马神经元NMDA受体NR2B亚基表达的调节作用。结果显示：模型对照组与正常对照组比较，大鼠海马神经元CA1区与CA3区NMDA受体亚基NR2B表达明显增多，益智仁治疗组与模型对照组比较，能够降低束缚应激大鼠海马CA1区与CA3区NMDA受体亚基NR2B的表达。已有研究表明：慢性复合应激对大鼠海马NMDA受体NR2B亚基的表达增强[4]，慢性应激使大鼠海马NMDA受体通道开放概率明显增高，而加味四逆散能明显降低应激性抑郁症大鼠海马NMDA受体通道开放概率[19]，也与本实验结果相吻合。

益智仁为姜科植物益智的干燥成熟果实，性温味辛，入脾胃经，有温脾止泻，摄唾涎，固精缩尿的功效，用于脾寒泻泄，腹中冷痛，口多唾涎，肾虚遗尿，小便频数，遗精白浊。有研究显示：益智仁有提高小鼠抗疲劳、耐缺氧和耐高温的能力[20]，以及益智仁对束缚应激大鼠海马神经元损伤有明显保护作用[13]，降低束缚应激致使大鼠海马神经元Ca2+浓度升高的调节作用[14]，说明益智仁具有抗应激作用。本研究结果显示，慢性束缚应激可使大鼠海马CA1区和CA3区NMDA受体亚基NR2B表达增强，益智仁能降低束缚应激大鼠海马CA1区和A3区NMDA受体亚基NR2B的表达，进一步说明益智仁具有抗应激作用，并提示NMDA受体可能是其药理学作用靶点之一, 并且，有研究发现，益智仁具有体外显著抑制谷氨酸兴奋毒性及诱发的神经细胞凋亡作用[10]，这也与本研究机制相吻合，即：应激造成海马神经元谷氨酸兴奋毒性产生，而使海马神经元NMDA受体亚基NR2B表达增强，进而大鼠体内灌注益智仁水提取物使NMDA受体亚基NR2B表达增强得到明显降低。所以，调控海马神经元NMDA 受体的功能状态可能是益智仁发挥抗应激效应的直接作用机制之一，但是，益智仁抗应激作用的机制还需进一步研究。

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Yi Zhi Ren’s Effect on the Expression of NR2B Protein in Restrained Stress Rat Hippocampal Neurons

SUN Li, XIE Xia, LIU Chao, WANG Hui

(Medical College of Dalian University, Dalian 116622, China)

To investigate Yi Zhi Ren’s effect on the expression of NR2B protein in restrained stress rat hippocampal neurons, 30 SDrats were divided averagely and randomly into three groups: normal control group, model control group and Yi Zhi Ren group. In three weeks, the rats in model control group and Yi Zhi Ren group were restrained once every day. The rats in the third group were perused Yi Zhi Ren into stomach before restrained. Immunohistochemical staining for the expression of NR2B protein was performed in rat hippocampal neurons. The positive reaction product of NR2B was stained brown. They mainly deposited in pyramidal cell layer of hippocampal CA1 and CA3 regions. Compared with the normal control groups, the mean optical density (MOD) of NR2B positive reaction product in model control group was significantly increased (P＜0.01). The MODof NR2B positive reaction product in Yi Zhi Ren group was significantly decreased compared with model control group (P＜0.05). These results suggest Yi Zhi Ren may decrease the expression of NR2B protein in rat CA1 and CA3 hippocampal neurons induced by restrained stress.

Yi Zhi Ren; restrained stress; rat; hippocampal; NR2B

R285.5

A

1008-2395(2012)03-0061-04

2012-03-21

2010年大连市科技计划项目（2009E12SF139）。

孙莉（1964-），女，副教授，研究方向：生理学、行为医学。