灭活的双歧杆菌对小鼠肠液中分泌型IgA水平的影响

孙 杰，王丽红，官 娜，黄 敏*

（1. 大连港医院 检验科，辽宁 大连 116013；2. 大连医科大学 微生物学教研室，辽宁 大连 116027）

灭活的双歧杆菌对小鼠肠液中分泌型IgA水平的影响

孙 杰1，王丽红1，官 娜1，黄 敏2*

（1. 大连港医院 检验科，辽宁 大连 116013；2. 大连医科大学 微生物学教研室，辽宁 大连 116027）

为观察灭活的双歧杆菌对小鼠肠液中SIgA水平的影响，将小鼠腹腔注射环磷酰胺造成免疫抑制动物模型，分别以新鲜BS肉汤培养基、耗尽培养上清（SCS）以及死、活双歧杆菌菌液进行灌胃。采用双抗体夹心法合并间接法检测肠液中SIgA的含量。结果显示灭活的双歧杆菌与双歧杆菌活菌均可提高免疫抑制小鼠肠液中SIgA的含量, 二者的作用效果差异无显著性（P＞0.05），SCS也具有一定的免疫促进作用，但与双歧杆菌活菌相比差异有显著性（P＜0.05）。灭活的双歧杆菌具有与双歧杆菌活菌相同或相近的免疫学活性，两者均可提高小鼠肠液中SIgA水平。

双歧杆菌；灭活；免疫抑制；分泌型IgA

双歧杆菌作为人和动物肠道中最重要的生理性细菌之一，在肠道内参与宿主的消化、营养、代谢、吸收、免疫及抗感染过程。将双歧杆菌作为生物反应调节剂经口服或经非胃肠道途径给予宿主，可激活机体免疫系统中的淋巴细胞、巨噬细胞及NK细胞等多种免疫效应细胞，使之分泌IL-21、IL-22、IL-26、IFN-2[1]等多种细胞因子以及在粘膜表面产生分泌型IgA（Secretory IgA, SIgA）[2]，从而提高机体局部或全身的防御功能，发挥自稳调节、抗感染、抗肿瘤效应。目前广泛使用的双歧杆菌活菌制剂存在着有效期短、含菌量不稳定、易被其他细菌污染等缺点。本文主要通过研究灭活的青春双歧杆菌DM8504对Balb/c小鼠肠液中SIgA水平的影响，以确定灭活的双歧杆菌是否具有与活菌相同或相近的免疫学效应。

1 材料与方法

1.1 菌种

双歧杆菌DM8504菌株为大连医科大学微生态学研究所保存菌种。经中国科学院微生物研究所鉴定，该菌株属于青春型双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）。

1.2 实验动物

纯系Balb/c小鼠，6～8周龄，体重18～22g，雌雄各半，购自大连医科大学实验动物中心。

1.3 主要试剂

Purified Mouse IgA、Rat Anti-Mouse IgA、Goat Anti-Mouse IgA、Rabbit Anti-Goat IgG-HRP均购自美国BD公司，其它试剂均为国产分析纯。

1.4 双歧杆菌培养

将双歧杆菌接种至BS肉汤培养基中，37℃培养48h。将菌液4 000 rpm离心10 min，分离得到耗尽培养上清（Spent Culture Supernatant，SCS）备用。用PBS重悬双歧杆菌沉淀，所得菌悬液分为活菌（Bifidobacteria, Bif）组和灭活菌（Heatkilled Bifidobacteria, HBif）组。将HBif组置于65℃水浴，30 min灭活处理（经BS肉汤检菌，证明无活菌存在，并且仍保持正常细菌形态）。将处理后的HBif组和Bif组菌液4 000 rpm离心10 min，弃上清，用SCS重悬双歧杆菌沉淀，调整两组菌悬液浓度均为1×109CFU/mL。

1.5 实验动物分组与造模

将50只纯系Balb/c小鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半，分别为生理盐水（NS）组、环磷酰胺（CTX）组、耗尽培养上清（SCS）组、灭活菌（HBif）组、活菌（Bif）组。NS组小鼠腹腔注射无菌NS 0.3mL/只，其余四组小鼠分别腹腔注射CTX溶液（5 mg/mL）0.3 mL/只，1次/天，连续3天。从第4天起NS组和CTX组小鼠用新鲜BS肉汤培养基灌胃，SCS组小鼠用SCS灌胃，HBif组和Bif组小鼠分别用1×109CFU/mL灭活的双歧杆菌菌液和双歧杆菌活菌液灌胃，均为0.5 mL/只，连续14天。

1.6 检测小鼠肠液中SIgA水平

将免疫后的小鼠摘眼球处死，取盲肠和回肠末端5 cm肠段。将肠管内翻暴露肠内壁，用5mLNS冲洗肠内壁20次。将所得冲洗液3000 rpm离心10 min，取上清，分装5个冷冻真空干燥小瓶，1mL/瓶，经冷冻真空干燥得粉末。测定时每瓶中加入0.5mLNS，使粉末完全溶解，得到检测样品。以双抗体夹心法合并间接法检测SIgA，具体操作按余贺等方法[3]，个别步骤略有改动。将200 ng/mL的Rat-Anti-Mouse IgA加入96孔板中，100 uL/孔，4℃ 24h。洗板3次，每孔中加入100 uL1%牛血清白蛋白（BSA）封闭板，37℃ 2h。洗板3次，将检测样品和不同稀释度的标准品（0、5、10、20、40、80、160、320、640 ng/mL）加入相应的孔中，100 uL/孔，室温（20～25℃）2h。洗板3次，每孔中加入100 ng/mL的Goat-Anti-Mouse IgA100 uL，室温（20～25℃）1h。洗板3次，每孔中加入稀释度为1:6000的检测工作液即Rabbit-Anti-Goat IgG-HRP 100uL，室温（20～25℃）1h。洗板3次，每孔中加入底物液TMB100 uL，避光，室温放置15 min。加入50 uL终止液（2mol/LH2SO4），混匀后即刻（5 min内）测量OD值（测定波长为450 nm）。

1.7 统计方法

所有结果均以均值±标准误（X±SE）表示，多组间两两比较用q-test。所有数据均用SPSS10.0统计软件进行分析。

2 结果

结果表明（见表1），CTX可降低小鼠肠液中SIgA的含量，与NS组相比具有显著性差异（P＜0.01）。SCS、HBif和Bif均可提高免疫低下小鼠肠液中SIgA的含量，与SCS组相比，HBif和Bif的作用效果较强，具有显著性差异（P＜0.01）。HBif与Bif相比，后者对SIgA含量的提高效果更明显，但两者无显著性差异（P＞0.05）。

表1 灭活的双歧杆菌对小鼠肠液中SIgA水平的影响

3 讨论

双歧杆菌作为一种革兰氏阳性益生菌，是人和动物肠道中正常菌群的重要组成部分。双歧杆菌具有明显的免疫赋活作用，可提高机体局部或全身的防御功能，发挥自稳调节、抗感染、抗肿瘤效应。双歧杆菌粘附于肠上皮细胞后，可穿越M细胞，从而激活免疫系统，引发一系列免疫反应。目前已有实验证实灭活的双歧杆菌具有与活菌相同的粘附于肠上皮细胞的能力[4]。

分泌型SIgA作为粘膜免疫系统中的主要抗体类型之一，能抵抗肠道蛋白酶的分解作用，在粘膜免疫中起着重要的作用。然而除了母乳喂养婴儿之外，机体获得外源性SIgA的方式是非常有限的。主要是通过激活机体免疫系统产生内源性SIgA，这种方式对宿主免疫系统的发育和成熟是非常有效的，而且其效应是长期的。由结果可知，小鼠经双歧杆菌灌胃后可刺激肠粘膜分泌大量的SIgA。E-JKO等认为双歧杆菌对肠粘膜中的B细胞具有促有丝分裂活性，从而提高B细胞合成分泌SIgA的能力，这一过程需要CD4+T细胞及其分泌的多种细胞因子的参与[5]。研究发现，经65℃30 min热处理灭活的双歧杆菌提高机体免疫力的能力丝毫不逊于双歧杆菌活菌，表明双歧杆菌作为益生菌制剂的常用菌种, 并非必须采用活菌，而且死菌本身具有极高的稳定性和安全性, 这就为死菌制剂的广泛应用奠定了基础。此外，不仅双歧杆菌可提高机体的免疫力，双歧杆菌的SCS对机体的免疫力也有一定的调节作用，这与前期研究结果相一致[6]。

已有研究表明，在对数期时活菌的免疫活性高于死菌，而在静止期时死菌的免疫活性高于活菌，但若想达到相同的免疫效应水平，死菌的浓度一般都需高于活菌[7]。由此可以推测，细菌的生长阶段对其生物学活性有着较强的影响。细菌与细胞间的相互作用是由菌体表面的热敏感结构介导的，然而其作用的强弱程度可能是由其中的耐热成分决定的。因此，在静止期经热处理灭活的较高浓度的死菌可具有与活菌相同的免疫学效应。

[1] PLANTINGA TS, VAN MAREN WW, VAN BERGENHENEGOUWEN J, et al. Differential Toll-like receptor recognition and induction of cytokine profile by Bifidobacterium breve and Lactobacillus strains of probiotics [J]. Clinical and Vaccine Immunology, 2011, 18(4): 621-628.

[2] YANG H, LIU A, ZHANG M, et al. Oral administration of live Bifidobacterium substrains isolated from centenarians enhances intestinal function in mice [J]. Current Microbiology, 2009, 59(4): 439-445.

[3] 余贺, 谢少文, 杨贵贞, 等. 临床免疫技术[M]. 上海科学技术出版社, 1982: 210-213.

[4] 伦永志, 黄敏, 袁杰利, 等. 灭活的青春双歧杆菌对人大肠癌细胞的粘附[J]. 微生物学通报, 2003, 30(4): 55-59.

[5] KO E J, GOH JS, LEE B J, et al. Bifidobacterium bifidum exhibits a Lipopolysaccharide-like mitogenic activity for murine B lymphocytes[J]. Journal of Dairy Science, 1999, 82(9): 1869-1876.

[6] 纪芳, 黄敏, 伦永志, 等. 灭活的双歧杆菌对小鼠血清中细胞因子水平的影响[J]. 中国微生态学杂志, 2003, 15(2): 78-79.

[7] HALLER D, BODE C, HAMMES WP. Cytokine secretion by stimulated monocytes depends on the growth phase and heat treatment of bacteria: A comparative study between Lactic Acid Bacteria and invasive pathogens [J]. Microbiology and Immunology, 1999, 43(10): 925-935.

Effect of Heat-killed Bifidobacterium on the Production of SIgA in Intestinal Juice of Mice

SUN Jie1, WANG Li-hong1, GUAN Na1, HUANG Min2*

(1.Department of Clinical Laboratory, Dalian Port Hospital, Dalian 116013, China; 2. Department of Microbiology, Dalian Medical University, Dalian 116027, China）

To explore the effect of heat-killed bifidobacteria on the production of SIgA in intestinal juice of mice. Got immunosuppressing mice by intraperitoneally in jecting CTX. Five groups of mice were administrated orally with fresh BS culture medium、SCS、heat-killed bifidobacteria and live bifidobacteria. Evaluated the production SIgA of by double antibody sandwich methods and indirect of ELISA assay. Both heat-killed bifidobacteria and live bif ido bacteria could increase the production of SIgA, but there was no significant difference between two groups (P＞0.05). SCS could improve the immunity of immunosuppressing mice in some degree, bu t it was a little weaker (P＜0.05). Heat-killed bifidobacteria and live bifidobacteria had the same or similar biological activity and both could improve the production of SIgA in intestinal juice of mice.

Bifidobacterium; heat-killed; immunosuppression; secretory IgA

Q939.9

A

1008-2395(2012)03-0053-03

2012-04-10

孙杰（1978-），女，主管检验师，研究方向：临床微生物检验。

黄敏（1955-），男，教授，博士生导师，研究方向：生物因素抗肿瘤研究。