厄贝沙坦对巨噬细胞凝集素样氧化低密度脂蛋白受体（LOX-1）基因及蛋白表达的影响

林令君，王晓俐，张绪洪，吕晓霞，田洪波，朱艳丽

（山东大学附属省立医院1.心血管科 ；2.老年心血管科；3.中心实验室，山东 济南 250021）

厄贝沙坦对巨噬细胞凝集素样氧化低密度脂蛋白受体（LOX-1）基因及蛋白表达的影响

林令君1，王晓俐*2，张绪洪1，吕晓霞3，田洪波1，朱艳丽2

（山东大学附属省立医院1.心血管科 ；2.老年心血管科；3.中心实验室，山东 济南 250021）

目的 研究不同浓度厄贝沙坦对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的人单核/巨噬细胞系（THP-1）凝集素样氧化低密度脂蛋白受体（LOX-1）mRNA和蛋白表达的影响，并探讨其可能的机制。 方法 THP-1细胞经0.16μmoL/L佛波酯诱导分化后，将细胞分为3组：对照组、AngⅡ组、厄贝沙坦干预组，干预组分别加入不同浓度厄贝沙坦孵育2 h后，再加入AngⅡ1×10-6moL/L孵育24 h，用荧光定量PCR和细胞酶联免疫法检测（LOX-1）mRNA和蛋白表达。结果 与对照组比较，Ang II可明显上调THP 1细胞（LOX-1）mRNA和蛋白表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同浓度厄贝沙坦均能抑制（LOX-1）蛋白表达（P＜0.05），并且随着厄贝沙坦浓度降低，抑制作用减低，即两者呈浓度依赖性。结论 厄贝沙坦以浓度依赖方式抑制AngⅡ诱导的THP 1细胞（LOX-1）mRNA和蛋白表达，减少巨噬细胞通过（LOX-1）途径的氧化低密度脂蛋白（oxLDL）摄入，影响泡沫细胞的发生、发展，发挥其抗动脉粥样硬化（AS）作用。

厄贝沙坦；人单核/巨噬细胞系；凝集素样氧化低密度脂蛋白受体

动脉粥样硬化（Atheroslerosis，AS）是心血管疾病的基础病理改变，研究证实，血管紧张素II（angiotensinⅡ，AngⅡ）及其受体在AS形成中有重要作用，AngⅡ1型受体拮抗剂（angiotensinⅡ1 type receptor blockers，ARB）可通过多条途径减缓或逆转AS[1-2]。本研究旨在进一步研究厄贝沙坦（Irbesartan）对AngⅡ诱导的THP 1细胞（LOX-1）基因和蛋白表达的影响，以探讨Irbesartan在抗AS中的地位和作用，并为Irbesartan的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人单核/巨噬细胞株（THP-1细胞）购自中国科学院上海细胞库，AngⅡ购自上海肽仕生物有限公司；厄贝沙坦由赛诺菲安万特制药有限公司提供；佛波酯（PMA）购自Sigma公司；RPMI-1640培养基购自美国 Hyclone公司；胎牛血清购自TBD公司；Trizol RNA提取试剂、PCR引物、逆转录试剂盒及PCR试剂盒均购买自大连宝生物公司；兔抗人LOX-1多克隆抗体购自abcam公司；山羊抗兔二抗及酶联物购自北京中杉金桥生物有限公司；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 细胞培养及实验分组

1.2.1 THP-1细胞的培养和诱导转化 THP 1细胞置于含10%胎牛血清RPMI-1640培养基中，37℃、5% CO2孵箱内培养。诱导转化时加0.16μmoL/L PMA72 h以促使单核细胞分化成巨噬细胞，之后用PBS洗涤两遍，置于无PMA及血清的RPMI-1640培养液中24 h，开始后续试验。

1.2.2 试验分组 对照组：培养基；AngⅡ组：分别加入1×10-6moL/、1×10-7moL/L、1×10-8moL/L、1×10-9moL/L AngⅡ作用24 h；厄贝沙坦干预组：分别加入1μmoL/L，0.1μmoL/L，0.01μmoL/L的厄贝沙坦预先孵育2 h后，再加入1×10-6moL/L AngⅡ作用24 h。

1.3 荧光定量PCR检测（LOX-1）mRNA表达

1.3.1 RNA提取 各组培养皿中分别加入1 mL Trizol RNA提取试剂，按照说明书操作，依次经过氯仿处理，异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤后，略干燥，溶于DEPC处理水。经核酸紫外分析仪检测，确定样品中RNA纯度（A260/A280=1.80～2.00）和浓度。

1.3.2 逆转录反应 应用ABI PRISM 7500 Realtime PCR System 操作，PCR引物由大连宝生物公司合成，以GAPDH为内参。LOX-1引物序列：上游5′T TA C T C T C C AT G G T G G T G C C3′,下游5′AGCTTCTTCTGCTTGTTGCC3′,产物193 bp；GAPDH引物序列：上游5′GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3′,下游5′TGGTGAAGACGCCAGTGGA3′，产物138bp。建立20μL反应体系，含SYBR Premix Ex Taq 10μL，上下游引物各0.4μL，ROX Reference DyeⅡ0.4μL，逆转录产物2μL，灭菌蒸馏水6.8μL。扩增条件为：①95℃变性30 s；

1.4 细胞酶联免疫法检查LOX-1蛋白表达

参考Yang等[3]方法并加以改动。将THP-1细胞于96孔板培养，经PMA诱导转化、加药物干预，每个观察值设3个复孔，药物作用达预定时间后弃掉培养液，用PBS清洗，4%多聚甲醛固定20min，脱脂奶粉封闭30min，加兔抗人LOX-1多克隆抗体37℃ 孵育2 h，生物素化山羊抗兔IgG 37℃ 孵育1 h，酶联物37℃ 孵育1 h，加入TMB显色15min,终止液终止反应，用450 nm酶标仪测吸光度（A）。结果以A450表示LOX-1蛋白表达水平。

1.5 数据处理及统计学分析

荧光定量PCR反应后的数据应用2-△△Ct进行处理，2-△△Ct 表示目的值相对于参照值的相对倍数。用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，实验数据以“”表示，组间比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 THP-1细胞分化成巨噬细胞

THP-1细胞呈圆形、悬浮生长，经 0.16μmoL/L PMA诱导分化72 h后，由悬浮生长变为贴壁生长，形状不规则，且伸展伪足，呈现巨噬细胞外形。见图1。

图1 THP-1细胞PMA诱导分化前后形态学变化光镜图

2.2 AngⅡ对THP-1细胞（LOX-1）mRNA和蛋白表达的影响

以GAPDH为内参照，进行荧光定量PCR，扩增曲线呈典型的S型曲线，融解曲线分析可见只有单峰值，排除了非特异性扩增。用细胞酶联免疫法检测TH-1细胞（LOX-1）蛋白表达。不同浓度AngⅡ均可明显上调THP-1细胞（LOX-1）mRNA和蛋白表达，随着AngⅡ浓度的增加，其（LOX-1）mRNA和蛋白表达也增加，呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。 结果如图2-3所示。

2.3 厄贝沙坦对AngⅡ诱导的THP 1细胞（LOX-1）mRNA和蛋白表达的影响

分别加入1μmol/L、0.1μmol/L、0.01μmol/L不同浓度的厄贝沙坦预先孵育2 h后，再加入1×10-6moL/L AngⅡ作用24 h，用荧光定量PCR法和细胞酶联免疫法检测由AngⅡ诱导的THP-1细胞LOX-1mRNA和蛋白的表达。浓度分别为1μmol/L、0.1μmol/L、0.01μmol/L各厄贝沙坦组THP-1细胞LOX-1mRNA和蛋白表达均有不同程度下降，各厄贝沙坦组间两两比较差异有统计学意义（P＜0.01）。结果表明不同浓度厄贝沙坦均能抑制由AngⅡ诱导的THP 1细胞LOX-1基因和蛋白表达，并且随着厄贝沙坦浓度降低，其抑制作用减弱，两者呈浓度依赖性。结果见图4-5。

图2 Ang II对诱导分化后THP-1细胞（LOX-1）mRNA 表达的影响

图3 Ang II对诱导分化后THP-1细胞（LOX-1）蛋白表达的影响

图4 厄贝沙坦对THP-1细胞（LOX-1）mRNA表达的影响

图5 厄贝沙坦对THP-1细胞LOX-1 蛋白表达的影响

3 讨论

泡沫细胞的形成是AS发生、发展关键，它主要源于血液中单核细胞转变成巨噬细胞，通过清道夫受体摄取氧化型低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL）后转变而来。凝集素样氧化低密度脂蛋白受体（Lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor 1，LOX-1）是sawamura[4]等在1997年首次在牛内皮细胞上发现Ox-LDL的受体，为Ⅱ型膜蛋白，结构上属于C型血凝集素家族，能够特异性地结合、吞噬和降解Ox-LDL。

AngII是重要致AS因子，不仅存在于循环中，局部组织及细胞中也大量存在[5]。在本实验中，我们发现AngⅡ伴随浓度增加，可明显上调THP-1细胞（LOX-1）mRNA和蛋白表达，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

厄贝沙坦（Irbesartan）是一种非肽类血管紧张素Ⅱ（Ang II）受体（AT）拮抗剂，它与AT1受体有高度的亲和性，而不与AT2受体结合，是非竞争性AT1受体阻断剂。

本研究我们采用体外培养人单核/巨噬细胞系作研究对象，首次观察不同浓度厄贝沙坦对AngⅡ诱导的THP-1细胞LOX-1基因转录和蛋白表达的影响。结果发现：各厄贝沙坦组均能抑制AngⅡ诱导的巨噬细胞LOX-1基因转录和蛋白表达，差异有统计学意义（P＜0.05）；随着厄贝沙坦浓度减低，抑制作用也逐渐减弱，两者呈浓度依赖性。而1 umoL/L厄贝沙坦则能完全抑制AngⅡ诱导的巨噬细胞LOX-1基因转录和蛋白表达，使LOX-1基因转录和蛋白水平接近正常对照组（P＞0.05）。提示厄贝沙坦能够以浓度依赖方式，抑制AngⅡ诱导的THP 1细胞LOX-1基因转录和蛋白表达。

[1]Gillis JC,Markham A,Irbesartan.A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and therapeutic use in the management of hypertension[J].Drugs,1997,54(6):885-902.

[2]Hanefeld M,Abletshauser C.Effect of the angiotensin II recept or antagonist valsartan on lipid profile and glucose metabolism in patients with hypertension[J].J Int Med Res,2001,29(4):270-279.

[3]Yang XY,Jiang HG,Hartmann WK.Development of a quantitative antigenspecific cell based ELISA for the 7G7/B6 monoclonal antibody directed toward IL-2Ra[J].Journal of Immunological Methods,2003,277(1):87-100.

[4]Sawamura T,Kume N,Aoyama T,et al.An endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein[J].Nature,1997,386(6620):73-77.

[5]Madamanchi NR,Vendrov A,Runge MS.Oxidative stress and vascular disease[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005,25(1):29-38.

Effects of irbesartan on expression of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 mRNA and protein in cultured THP-1 cells

LIN Ling-jun1,WANG Xiao-li2,ZHANG Xu-hong1,LV Xiao-xia3,TIAN Hong-bo1,ZHU Yan-li2
(1.Department of Cardiology;2.Depatment of Geriatric Cardiology;3.Central laboratory,Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan,Shandong 250021,China)

Irbesartan;THP-1;LOX-1

R963

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2012.08.003.007.03

〔Absrract〕Objective To investigate the influence of irbesartan on expression of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 mRNA and protein in cultured THP-1 cells Methods THP-1 cells were differentiated by incubation with 160nM PMA for 72 hours.The cells were divided into three groups:control group, AngⅡgroup and irbesartan intervention group. The intervention groups were first treated with several concentration irbesartan for 2 hours, then coincubated with AngⅡ1×10-6moL/L for24h. Real time PCR and enzyme-linked immunosorbent assay technology were used to detect (LOX-1) mRNA and protein expression.Results AngⅡ induced the increase of THP-1 (LOX-1) mRNA and protein expression(P＜0.05). Several concentration irbesartan groups blocked AngⅡ-induced (LOX-1) mRNA and protein expression,The decrease in (LOX-1) expression was dependent on irbesartan concentration. Conclusion Irbesartan can blocke AngⅡ-induced( LOX-1) mRNA and protein expression in a concentration-dependent and reduce intake of macrophages on the oxidized low density lipoprotei via (LOX-1) pathway, affecting the foam cell development,exert their effect on anti-atherosclerosis.

2012－02－21

山东省自然科学基金（Y2006C129）。

林令君（1983－），女，山东人，硕士研究生，主要研究老年心血管疾病临床诊断与治疗。

*王晓俐，主任医师，E-mail：wangxiaoli3@medmail.com.cn。

(本文编辑: 韩志涛)