五氯酚对稀有鮈鲫胚胎毒性效应研究

熊 力,马永鹏,毛思予,苏永良,金帮明,刘 堰* (.西南大学生命科学学院,淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室,水产科学重庆市市级重点实验室,重庆 40075；.重庆市第三人民医院检验科,重庆市临床检验中心,重庆 40006)

五氯酚对稀有鮈鲫胚胎毒性效应研究

熊 力1,马永鹏2,毛思予1,苏永良1,金帮明1,刘 堰1*(1.西南大学生命科学学院,淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室,水产科学重庆市市级重点实验室,重庆 400715；2.重庆市第三人民医院检验科,重庆市临床检验中心,重庆 400016)

研究五氯酚(PCP)对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸和毒性效应.以7.5,30,60,120,250μg/L5个浓度的PCP对0hpf(hpf,受精卵孵出时间)的稀有鮈鲫胚胎进行暴露染毒,同时设置空白对照组、二甲基亚砜溶剂对照组和雌二醇(EE2,2.5ng/L)阳性对照组.在立体显微镜下观察整个胚胎的发育过程,统计胚胎的孵化率、96hpf相对存活率和各时期的畸形率,并利用半定量RT-PCR检测胚胎中CYP1A基因和p53基因mRNA的表达.结果表明,PCP暴露能延迟稀有鮈鲫胚胎发育,并造成胚胎卵凝结、心包囊肿、脊柱弯曲等多种畸形甚至死亡.随着PCP暴露浓度的升高,稀有鮈鲫胚胎的孵化率和96hpf相对存活率降低,各时期的畸形率增加,并呈现一定的浓度效应.稀有鮈鲫胚胎CYP1A基因和p53基因mRNA表达被显著诱导,并随PCP浓度的升高而增加.PCP对稀有鮈鲫胚胎发育表现为显著的毒性效应.稀有鮈鲫胚胎孵化率、96hpf相对存活率、各时期畸形率及CYP1A基因和p53基因的诱导表达可以作为评价PCP毒性作用的敏感指标.

稀有鮈鲫；胚胎发育；五氯酚；毒性效应；CYP1A；p53

五氯酚(PCP)及其钠盐作为一种高效廉价的杀虫剂、木材防腐剂及除草剂,在世界范围内广泛使用. PCP是氯酚类中最具毒性和最难降解的有机污染物,被美国EPA列为优先检测污染物和潜在致癌物,也是我国优先监测污染物之一[1-2].其曾在中国长江中下游11个省、市、自治区被大范围、长时间地用于杀灭钉螺和控制血吸虫病,最终进入水体生态系统对水环境造成了持久污染[3-5].PCP性质较稳定,不易被氧化,易积累,具有很强的致癌、致畸、致突变性[6-7].对于多种鱼类,PCP都具有强毒性,其 96hLC50值在 32～205μg/L之间[8].PCP可导致稀有鮈鲫血细胞和肝细胞DNA明显的断裂和迁移,造成DNA损伤[9],具有显著的遗传毒性.

利用鱼类胚胎发育技术测定化学品的毒性作用具有材料方便易得、操作简单、可重复性及可靠性较高等优点,而且与传统的鱼类急性实验相比,成本低、影响因素少、灵敏度更高,现已被广泛应用于化合物的致毒和致畸效应研究[10].稀有鮈鲫作为中国特有的一种实验用鱼,具有个体小,对温度、溶解氧等环境条件适应性强,饲养方便,不易染病等优点,而且繁殖季节长,饲养条件下可以周年产卵,性成熟快,在水温适宜和饵料充足条件下4个月左右即可达到性成熟并产卵[11].已有试验证实,稀有鮈鲫对重金属、农药等化学品非常敏感,是进行化学品毒性测试和环境水样毒性实验的理想材料[12].但目前利用稀有鮈鲫胚胎发育技术研究内分泌干扰物毒性效应的工作还未见报道.因此,本研究以稀有鮈鲫的胚胎作为实验材料,观察 PCP暴露引起的胚胎发育变化,统计胚胎的孵化率、96hpf相对存活率、各时期的畸形率来评价PCP的发育毒性和致畸性,并选择 CYP1A基因和抑癌基因 p53为生物标志物,为从分子水平上进一步探讨五氯酚的胚胎毒性作用机制提供基础.

1 材料和方法

1.1 实验生物

健康的稀有鮈鲫种鱼购于中国科学院武汉水生生物研究所,在本实验室饲养繁殖超过4年,每天早晚喂养盐水孵化的丰年虫(丰年虫卵购于天津丹阳水产有限公司).实验用鱼为性成熟的健康成鱼体重:(0.53 ± 0.15)g, 体长:(36.6± 3.7)mm.按照雌雄比 1:2养在水族箱中,水温: (26±1)℃、光照/黑暗周期=12h/12h,饲养2周后开始收集鱼卵.饲养用水为连续曝气24h的自来水,pH:7.6±1.5,溶解氧在 5mg/L以上,总硬度为7.8±0.7德国度.

1.2 实验试剂及仪器

试剂:五氯酚(PCP,纯度:99%)购于 Chem. Service,雌二醇(EE2,纯度:98%)购于美国SIGMA,以二甲基亚砜(DMSO:购于Sanland- Chem)为溶剂,配制成各需要的浓度(实际染毒溶液中DMSO的浓度不超过 0.01%,经DMSO染毒稀有鮈鲫胚胎预实验发现,DMSO浓度不超过0.01%时,稀有鮈鲫胚胎发育基本不受影响),Total RNA提取试剂(RNAiso Plus)、反转录试剂盒(Prime ScriptTMRT reagent kit)购于TaKara公司,其他试剂均为国产分析纯.

所用主要仪器:玻璃水族箱,缸外过滤器, Nikon elicspe 80i生物显微镜,Nikon双目立体显微镜,NUNC24孔细胞培养板,光照恒温培养箱,凝胶成像仪(美国Bio-Rad),Mini-PROTEAN电泳系统(美国Bio-Rad),大龙可调式连续加样移液器.

1.3 暴露实验

按照文献[10,13]方法设置稀有鮈鲫胚胎染毒实验,开始实验前配制7.5,30,60,120,250μg/L 5个浓度的PCP储备溶液(浓度选择依据本实验室2次预试验结果)和2.5ng/L一个浓度的EE2溶液作为阳性对照组,同时设置一个DMSO溶剂对照组和一个空白对照组.胚胎暴露染毒过程中的试验用水,均为超滤除菌并充分氧饱和、温度保持(26±1)℃ 的本地自来水.

由于化合物作用时间不同,作用靶位点各不相同,所以选择同一批受精卵产出后立即进行染毒实验,即 0hpf染毒.用立体显微镜挑选发育正常的稀有鮈鲫受精卵进行实验.选用 24孔细胞培养板作为染毒器具,每孔容积为 3mL,实验时每孔加入2mL试液,放入2枚受精卵,每块多孔板中,10孔为同一实验浓度,其余4个孔为空白对照,每个浓度在不同的板上做一个平行组.塑胶膜封面以免溶剂挥发改变实验浓度.将密封好的多孔板放在(26±1)℃的光照培养箱中培养.每12h换液一次.为保证实验统计的准确性,先后进行3次重复实验.

1.4 显微观察

参照文献[14]中斑马鱼可以观察的毒理学终点、不同类型指标,文献[15]中稀有鮈鲫胚胎不同时间的发育状态,在不同时间段(暴露染毒后12,24,36,48,60,72,84,96h)观察并记录胚胎发育过程中一些具有代表性的毒理学终点并进行拍照.并统计各实验组中稀有鮈鲫胚胎的孵化率、96hpf相对成活率、各时期畸形率(包括卵凝结、心包囊水肿、脊柱弯曲、尾部弯曲、发育异常等).

1.5 CYP1A和p53 mRNA定量分析

在稀有鮈鲫胚胎发育到 96hpf时,取出各实验组中存活的胚胎进行CYP1A和p53 mRNA定量分析,每实验组中3个胚胎合并为1个样品.使用RNAiso Plus试剂提取各组样品中总RNA,用紫外分光广度计测定其浓度和纯度,并用反转录试剂盒将等量的总 RNA反转得到 cDNA.取1μLcDNA为模板,进行PCR反应检测各实验组胚胎中CYP1A和p53的表达情况.PCR反应体系为50μL,其中Buffer为5μL,25mmol/L Mg2+4μL, 2.5mmol/L dNTP 2μL,10mmol/L上下游引物各2μL,Taq酶0.5U.以β-actin为内参,CYP1A引物为5' AAAGCAATGGCTCTAACGG 3'和5' CGCAGGATAGGGATGAAAT 3',扩增片段为 743bp, p53基因为 5' CCACCATGAGAGAACACCTGAT 3'和5'GCTGAGGAGCTTCATAGAGAACC 3', 扩增片段为144bp,β-actin引物为5' CTACAGCTTCACCACCACA 3'和5' ATACCGCAAGATTCCATAC 3',扩增片段为 231bp.PCR程序为94℃预变性 10min;94℃变性 40s,56℃退火 30s, 72℃延伸40s,35个循环;最后72 ℃ 10min.PCR产物在 4℃冰箱保存,1%琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统观察并拍照.用Quantity One软件分析图像.CYP1A和p53的mRNA定量结果以相同起始量的β-actin进行校正,并以它们和β-actin电泳带相对吸光度比值来表示.

1.6 数据统计

计算实验各组稀有鮈鲫胚胎的孵化率、96hpf相对成活率、各时期畸形率[16].所有数据均用平均值±标准偏差表示.利用 SPSS 13.0软件one-way ANOVA单因素方差分析比较处理组与对照组之间的差异显著性,P＜0.05表示差异显著.同时对差异显著的稀有鮈鲫胚胎孵化率、96hpf相对存活率及各时期畸形率与PCP浓度之间进行相关性分析.

2 结果

2.1 形态学观察

稀有鮈鲫受精卵呈半透明状,易于观察,在生物立体显微镜下可以清楚地观察到胚胎各不同时期的发育情况.本实验共观察了胚胎发育的 8个不同时期,空白正常组和PCP染毒组稀有鮈鲫胚胎各时期发育特征有明显区别(表1).

表1 正常组和PCP染毒组稀有鮈鲫胚胎各时期发育特征Table 1 Developmental characteristics of normal and PCP exposed G. rarus embryos

图1 不同浓度PCP处理后稀有鮈鲫胚胎发生畸变Fig.1 Deformation of G. rarus embryos after PCP treatment at different concentrations

各浓度 PCP处理后,稀有鮈鲫胚胎发育受到不同程度的影响,导致其胚胎和孵出幼鱼产生各种畸形效应,结果见图 1.从受精卵开始到PCP暴露12h,空白对照组和溶剂对照组稀有鮈鲫胚胎均未见异常症状,低浓度染毒组(＜30μg/L)发育也较正常,但高浓度染毒组(≥30μg/L)中则出现明显的中毒症状,其中部分胚胎出现明显卵黄浑浊或卵黄细胞被瓦解现象(图 1A).正常稀有鮈鲫胚胎在囊胚期细胞高度分裂,但在强PCP毒性作用下,染毒组胚胎在进入外包期前就停止发育,导致胚盘细胞损毁而发生卵凝结.随着 PCP染毒时间的增长,部分胚胎发育出现不规律的外包减少(图1B)或胚胎发育一段时间后卵黄开始畸变(图 1C).染毒 36h后,染毒组稀有鮈鲫胚胎出现胚中心包囊水肿现象(图 1D),说明 PCP进入胚胎后影响了胚胎中血液循环.染毒60h后,高浓度组未死亡的胚胎发育较正常组缓慢,而低浓度组胚胎已可见孵化雏形,部分胚胎在显微镜下发现黑色素沉积较少(图 2E).72h后,染毒稀有鮈鲫胚胎开始孵出,刚孵出的稚鱼较正常组短,大部分为畸形,表现为脊柱弯曲(图1F)、心包水肿(图1G)、躯体弯曲(图1H)、尾部弯曲(图1I).96h时,染毒组孵化的稀有鮈鲫幼鱼行动能力较弱,畸形加重出现死亡.随着 PCP暴露的浓度的增加,稀有鮈鲫胚胎发育的延迟作用越明显,且胚胎畸变的概率也增大.

2.2 稀有鮈鲫胚胎孵化率、96hpf相对存活率和各时期畸形率

由图2可见,在PCP暴露处理后,稀有鮈鲫胚胎的孵化率受到影响,并随着 PCP浓度的升高而降低.空白对照组和溶剂对照组胚胎的孵化率都在 90%以上,PCP暴露各组稀有鮈鲫胚胎孵化率均有下降.当 PCP暴露浓度≥30μg/L时,稀有鮈鲫胚胎的孵化率下降显著(P＜0.05),并呈现一定的浓度-效应关系(表 2),其相关系数R2为0.974. PCP暴露浓度为250μg/L组时,胚胎孵化率下降最为显著(P＜0.01)仅为 10%,说明胚胎在此高浓度 PCP暴露后,90%以上死亡.随着 PCP暴露浓度的升高,稀有鮈鲫胚胎96hpf的相对成活率也逐渐降低.当PCP暴露浓度≥30μg/L时,胚胎的96hpf相对成活率均下降显著(P＜0.05),呈现良好的浓度-效应关系,R2＞0.98. 250μg/LPCP暴露组稀有鮈鲫胚胎的96hpf相对成活率接近于0(P＜0.01),说明96hpf以后此浓度下几乎所有稀有鮈鲫胚胎均死亡.经过PCP暴露96h后,稀有鮈鲫胚胎的畸形率随PCP浓度的增加而增加.当暴露浓度≥60μg/L时,胚胎的畸形率增加显著(P＜0.05),与 PCP浓度呈现一定的效应关系,R2为0.9567. PCP浓度达到 250μg/L时,稀有鮈鲫胚胎的畸形率接近100%(P＜0.01). EE2阳性暴露组胚胎的孵化率、96h相对存活率和各时期畸形率与对照组相比也有显著差异,说明 EE2也会影响稀有鮈鲫胚胎的发育.

图2 不同浓度PCP和EE2暴露对稀有鮈鲫胚胎孵化率、96hpf相对成活率及畸形率的影响Fig.2 Hatching rate, 96hpf relative survival rate and deformation rate of G. rarus embryos exposed to various concentrations of PCP and EE2

2.3 CYP1A和p53 mRNA定量分析

在稀有鮈鲫胚胎发育到 96hpf时,通过RT-PCR检测发现,与空白对照组比较,PCP暴露各组胚胎中 CYP1A基因和抑癌基因 p53的mRNA表达量均随 PCP浓度的升高而增加(图3).CYP1A的半定量分析统计表明,空白、DMSO对照组及PCP、EE2各组胚胎中CYP1A表达量与β-actin基因的平均比值分别为:0.35、0.39、0.48、1.23、1.43、2.12、0.60(图4).DMSO溶剂对照组与空白对照组相比不明显, CYP1A基因mRNA表达量均较低.而PCP暴露各组中,CYP1A基因 mRNA表达均显著增加并均有统计学意义.EE2暴露组中胚胎 CYP1A表达也增加显著(P＜0.05).同时PCP暴露组中p53基因的表达量也随PCP暴露浓度的升高逐渐增加(图4).空白、DMSO对照组及PCP、EE2各组胚胎中p53表达量与 β-actin基因的平均比值分别为:1.50、 1.68、1.76、1.82、1.85、1.91、1.69.当PCP≥30μg/L时, p53基因mRNA表达量增加显著具有统计学意义,P＜0.05.EE2同样可以诱导胚胎中p53基因mRNA的表达,但效应不明显.

表2 稀有鮈鲫胚胎孵化率、96hpf相对存活率和畸形率与PCP的剂量效应方程Table 2 Dose-response equation between hatching rate, relative survival rate, deformation rate and PCP concentration in G. rarus

图3 CYP1A和p53基因mRNA表达的RT-PCR检测结果Fig.3 CYP1A and p53 expression after PCP exposure by RT-PCR

图4 不同浓度PCP和EE2暴露组稀有鮈鲫胚胎CYP1A和p53mRNA表达定量结果(n=6)Fig.4 CYP1A and p53 mRNA levels of G. rarus embryos exposed to various concentrations of PCP and EE2 by semi-quantitative RT-PCR

3 讨论

PCP作为一种典型的水体污染物,可影响生物体的发育.蒋琳等[18]已发现PCP单独暴露对斑马鱼胚胎发育具有较强的毒性效应,可导致胚胎产生各种畸形.本实验中通过形态学观察发现,PCP对稀有鮈鲫胚胎同样有显著的毒性效应.在12～24 hpf期稀有鮈鲫胚胎发育即进入分裂期,但PCP暴露染毒中的部分胚胎会出现严重的发育阻滞和卵黄凝结,从而影响稀有鮈鲫早期器官的形成,这些可作为稀有鮈鲫胚胎分裂期的致畸毒性终点指标.在 24～48hpf时,稀有鮈鲫胚胎发育进入成形期,血液循环系统逐渐成熟.此时部分PCP染毒胚胎可观察到心包囊肿、心率不稳等现象,它们同样可以作为评价毒性作用的生理指标.在染毒 72～84hpf时,低浓度染毒组开始孵化,但相对于空白和溶剂对照组已经延迟,而高浓度组仍然发育缓慢,说明稀有鮈鲫胚胎孵化时间的长短可以反映毒性作用的强弱.在染毒96hpf时,染毒组成活的稀有鮈鲫胚胎已全部孵化,可以观察统计其孵化率、96hpf相对成活率和各时期畸形率.而稀有鮈鲫胚胎在PCP和EE2暴露染毒发育过程中,这3个指标均与对照组有显著差异,并与PCP浓度呈现明显的效应关系.

有研究[18-19]显示,PCP暴露后斑马鱼胚胎发育过程中发展的fzd2、axin2等Wnt信号通路重要的调控基因表达均会发生显著变化.而且应用基因芯片技术发现,暴露于五氯酚的斑马鱼胚胎中有14个涉及细胞凋亡的基因表达发生了显著改变,说明PCP可能对胚胎发育具有基因毒性而导致其畸变甚至死亡.CYP1A是细胞色素 P450超家族的重要成员,参与多种环境致癌物、致突变物的代谢[20].CYP1A在正常鱼体内组织的浓度很低,但在外来持久性有机污染物的诱导下,它的活性会升高.这主要是由于CYP1A基因的表达被污染物诱导剂高度诱导,使其表达水平显著增加[21].因此,鱼类 CYP1A基因作为一种有效的生物标志物已被广泛的应用于对环境污染物的评价[22-23].鱼类胚胎发育时期对环境内分泌干扰物十分敏感,它们不仅能导致胚胎发育产生各种畸形,还能诱导胚胎组织中 CYP1A的表达,可见内分泌干扰物对CYP1A的诱导与其毒性作用密切相关[24].而p53基因是迄今为止发现的与肿瘤相关性最高的肿瘤抑制基因, 50%以上的肿瘤发生都与p53基因的突变或功能的失调有关[25].在正常生理状况下,p53表达水平很低,当受到外界环境刺激后,p53表达水平会升高[26],因此p53基因可作为环境污染物潜在致癌性的生物标志物.本研究中以稀有鮈鲫胚胎为研究对象,利用RT-PCR技术发现 PCP和 EE2可以诱导其中CYP1A基因和p53基因mRNA的表达,并随PCP浓度的增加而升高具有显著效应,进一步验证了PCP对胚胎发育的基因毒性作用,对于揭示其致癌性和致畸性机理有一定帮助.

4 结论

4.1 PCP和EE2能够影响稀有鮈鲫胚胎的发育,造成胚胎畸形发育迟缓、孵化率和96hpf相对成活率下降、畸形率增加.

4.2 PCP暴露染毒可以诱导稀有鮈鲫胚胎中CYP1A基因和p53基因mRNA的表达,并随PCP浓度的升高而增加具有显著的效应.

4.3 利用稀有鮈鲫胚胎发育评价PCP和EE2的致毒和致畸效应是可行的,对发现 PCP 的毒性作用机制、毒性敏感性及其在水体污染中的监测具有现实意义.

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Toxic effects of pentachlorophenol on the Chinese rare minnow embryos.

XIONG Li1, MA Yong-peng2, MAO Si-yu1, SU Yong-liang1, JIN Bang-ming1, LIU Yan1*(1.Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development, Ministry of Education, Key Laboratory of Aquatic Science of Chongqing, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2.Clinical Laboratory Center of Chongqing, Laboratory of the Third People’s Hospital of Chongqing, Chongqing 400016, China). China Environmental Science, 2012,32(2)：337～344

The carcinogenicity and toxicity of pentachlorophenol (PCP) exposure on the Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) embryos were investigated. G. rarus embryos at 0 hour past fertilization (hpf) were exposed to PCP at different concentrations (0, 7.5, 30, 60, 120, 250μg/L). DMSO(＜0.01%,V/V) and 17α-ethynylestradiol (EE2, 2.5ng/L) were set as solvent control and positive control, respectively. The embryonic development was observed under the stereomicroscope. The hatching rate, relative survival rate at 96 hpf, and deformity rate through the entire embryos developmental process were calculated. Furthermore, the mRNA expressions of CYP1A and p53 gene were analyzed by semi-quantitatively RT-PCR. PCP exposure resulted in delayed embryonic development, condensation of embryonic eggs, formation of pericardial cysts, curvature of the spine or even death. The hatching rate and relative survival rate at 96 hpf were reduced while deformity rate were increased in a dose dependent manner of PCP. The mRNA level of CYP1A and p53 in embryos also were significantly up-regulated with increasing PCP concentration. PCP had significant toxic effects on G. rarus embryos. The hatching rate, relative survival rate at 96 hpf, malformation rate, CYP1A and p53 expression levels can be used as sensitive biomarkers to evaluate the toxic effects of PCP exposure on fish embryos.

Gobiocypris rarus；embryonic development；pentachlorophenol；toxic effects；CYP1A；p53

2011-05-02

国家自然科学基金资助项目(21147002);国家“973”项目(2012CB723205);三峡库区生态环境教育部重点实验室科学研究基金;重庆市自然科学基金资助项目(CSTC.2009BB1131)

* 责任作者, 教授, liuyan@swu.edu.cn

X503.225

A

1000-6923(2012)02-0337-08

熊 力(1985-),男,湖北随州人,西南大学生命科学学院硕士研究生,研究方向为生物化学与分子生物学.发表论文2篇.