抗原处理相关转运体1 rs2071480基因多态性与新疆地区汉族变应性鼻炎相关性研究

陈庆勇，阳玉萍，向阳冰，谭国萍，张 华

(临床研究)

抗原处理相关转运体1 rs2071480基因多态性与新疆地区汉族变应性鼻炎相关性研究

陈庆勇，阳玉萍，向阳冰，谭国萍，张 华

目的 近年来抗原转运相关转运体1(transporter－associated with antigen processing 1，TAP1)rs2071480位点基因多态性与变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)遗传易感性的关系备受关注，但由于遗传和表型上的异质性，不同研究所获结果不尽一致，呈现的差异可能与种族有关。文中探讨新疆地区汉族人群TAP1*rs2071480位点单核苷酸多态性分布特点及与AR的关系。 方法 采用病例－对照研究方法，应用SNaPshot SNP分型技术对300名汉族人TAP1*rs2071480进行SNP位点分型，其中病例组150人，健康对照组150人。结论TAP1*rs2071480基因频率在病例组和健康对照组分布符合Hardy－Weinberg平衡定律。组间基因型频率分布和等位基因频率分布差异无统计学意义(P＞0.05)。结果TAP1 2071480基因单核苷酸多态性可能与新疆地区汉族人群易患AR无关。

抗原提呈相关转运蛋白1;单核苷酸多态性;变应性鼻炎;汉族

0 引 言

AR属于Ⅰ型变态反应，其发生与环境因素和遗传因素共同作用有关，但详尽的发病机制仍有待深入研究。目前认为AR是多基因遗传性疾病，IgE、T细胞受体、细胞因子及相应的受体等可能参与其发病机制［1－2］。近期研究提示人类抗原提呈相关转运蛋白1(transporter－associated with antigen processing1，TAP1)的基因多态性与AR易感性和严重性相关，在AR发病机制中可能起重要作用［3－4］。本文采用SNaPshot SNP方法分析新疆汉族人群TAP1基因多态性，探讨rs2071480基因位点多态性与新疆汉族AR的相关性及AR可能的遗传易感机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象 在新疆居住满1年以上的汉族人，2周内未服用皮质类固醇、抗组胺药，无风湿性疾病、高血压、糖尿病及其他与组织相容性抗原相关疾病。本研究得到新疆医科大学第一附属医院伦理委员会的批准，参与者均签署知情同意书。①AR病例组:新疆医科大学第一附属医院耳鼻喉科门诊就诊的无血缘关系的汉族AR患者150名，其中男性79名，女性71名，年龄5～80岁，平均(35.03± 14.28)岁。诊断符合中华医学会2009年AR诊断标准［5］。完成AR专业问卷，行前鼻镜检查、皮肤点刺试验(阿罗格公司试剂)、血清总IgE检测。②健康对照组:在新疆医科大学第一附属医院体检的健康人150名，其中男59名，女91名，年龄2～76岁，平均(35.37±17.37)岁，询问病史，排除AR。行前鼻镜、皮肤点刺试验等检查。

1.2 主要试剂及仪器 血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物公司)，引物(上海生工公司)，dNTP (Generay Biotech公司)，Hotstar Taq(Qiagen公司)。3130xl genetic分析仪(ABI公司)，BG－Power 300电泳仪(北京百晶生物科技有限公司)，FR－250电泳仪(上海复日科技有限公司)，FR－110紫外分析装置(上海复日科技有限公司)，BG－submix cell电泳槽(北京百晶生物科技有限公司)，2720热循环仪(ABI公司)。

1.3 方法

1.3.1 外周血白细胞DNA的提取制备 抗凝血5 ml加入10 ml淋巴细胞分离液，水平离心机离心半径20 cm，1500 r/min，离心30 min，收集白细胞，用PBS洗涤2遍。应用氯仿法提取白细胞中的DNA，严格按照试剂盒操作。加TE溶解DNA，－20℃保存。FR－110紫外分析装置对DNA样本进行质量检查以及浓度估计并标化至浓度5～10 ng/μl。

1.3.2 引物设计与合成 序列特异性引物(sequence－specific primer，SSP)用Primer3软件设计，上海生工公司合成。rs2071480位点的引物序列如下:

1.3.3 PCR扩增 反应体系为10 μl，包含1×GC缓冲液I(Takara公司)，3.0 mmol Mg2+，0.3 mmol dNTP，1 U HotStarTaq聚合酶(Qiagen公司)，1 μl样本DNA和1 μl多重PCR引物。多重PCR引物浓度:2 μM。PCR仪扩增反应条件和循环程序如下。95℃变性2 min;94℃变性20 s，65℃退火40 s，72℃延伸90 s，进行11个循环，94℃变性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸90 s，进行24个。最后72℃延伸2 min;4℃保存。PCR产物纯化方法在10μl PCR产物中加入SAP酶1U和Exonuclease I酶1U，37℃温浴1 h，然后75℃灭活15 min。

1.3.4 SNaPshot多重单碱基延伸反应 延伸引物SF序列为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTTGCGCGCGGCGCTAAC延伸反应体系为10 μl，包括SNaPshot Multiplex Kit(ABI公司)5 μl，纯化后多重PCR产物2μl，延伸引物混和物1μl(引物浓度1.6 μmol)，超纯水2 μl。PCR循环程序;96℃预变性1min;96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸30 s，28个循环，4℃保存。延伸产物纯化:在10 μl延伸产物中加入1 U SAP酶，37℃温浴1 h，然后75℃灭活15 min。延伸产物测序:取0.5 μl纯化后的延伸产物与Liz120标准液0.5 μl、Hi－Di 9 μl混匀，95℃变性5 min。用ABI3130XL测序仪测序。收集的原始数据用GeneMapper 4.0软件(美国AppliedBiosystems公司)分析。

1.4 统计学分析 用SAS统计学软件对数据进行统计学处理。用PHASE2.0推断单倍型，用Hardy－Weinberg平衡检验样本遗传平衡状态及基因频率代表性。新疆汉族人群基因频率与NCBI基因库中其他种族人群基因型及基因频率分布差异比较用χ2检验。估计基因型频率计算等位基因频率。组间基因频率和等位基因频率比较用χ2检验。以P≤0.05为差异有显著性统计学意义。

2 结 果

2.1 汉族个体tSNP及单碱基电泳峰型图 TAP1 rs2017480位点电泳峰型见图1，TAP1 rs2017480位点单碱基延伸电泳峰型见图2。

图1 汉族不同SNP单碱基延伸电泳峰图Figure 1 SNaPshot electropherographic results of SNPs in Han people

图2 rs2017480位点单碱基延伸电泳峰型Figure 2 SNaPshot electropherographic results of rs2017480 (T/T，G/G，G/T)

图中橙色峰为标准峰型，蓝色、绿色、红色、黑色峰分别代表延伸加入 ddGTP、ddATP、ddTTP和ddCTP的延伸产物，峰下面的标注为等位基因。延伸引物为正向者，即与加入的碱基一致，如延伸引物为反向者，则与加入的碱基互补。

2.2 TAP1 rs2071480基因型及等位基因的分布及患病率风险估计 Hardy－Weinberg平衡检验见表1。rs2071480位点基因型分布均符合Hardy－Weinberg平衡(P＞0.05)，提示纳入的研究样本符合遗传平衡状态。该样本的基因频率可以代表本地区汉族人群的基因频率，基因型鉴定正确。

表1 汉族TAP1*rs2071480基因型分布Hardy-Weinberg平衡检验(n)Table 1 Dsitribution of rs2071480 genotype with Hardy-Weinberg test(n)

对照组和AR组的结果见表2。TAP1 rs2071480基因型分布以GT型最常见，等位基因以G分布频率最高，病例组与对照组基因型和等位基因频率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。提示此位点基因多态性可能与AR易感性无关。

NCBI基因库TAP1 rs2071480位点基因型分布与本研究基因型分布的比较见表3。rs2071480在不同地区、不同种族间分布存在差异。健康的新疆汉族人群(对照组)与人类多态性研究中心数据库中汉族人群的分布存在差异(P＜0.05)。

表2 TAP1*rs2071480位点基因型及等位基因分布Table 2 TAP1*rs2071480 genotypes and alleles in the case and control groups

表3 NCBI基因库与本研究TAP1 rs2071480位点基因型分布Table 3 Distribution of TAP1 rs2071480 gentypes in NCBI and this study

3 讨 论

AR是最常见的变态反应性疾病之一。其发病率在全球呈逐年增加的趋势，平均发病率约为10%～25%［6］。保守估计全球患者超过5亿人［7］，AR已成为了全球性的健康问题［8］。Zhang等［9］对我国11个城市AR电话调查表明AR患病率约为11%，钱迪等［10］对重庆、成都、乌鲁木齐、南宁进行的AR流行病学抽样调查结果AR总患病率为34.31%，其中乌鲁木齐AR患病率39.90%，诱因以灰尘和花粉为主，AR发病状况在各个地区均有不同特点。

AR属于多基因遗传性疾病，受遗传和环境的双重影响［11］，体外环境因素作用于机体导致发病。AR是IgE介导的变应性炎症反应，由Th1和Th2细胞介导的免疫应答失衡而引发，以鼻腔黏膜Th2细胞反应为主［12］。流行病学调查显示，遗传因素可能在AR发病机制中起重要作用［13］。国内外研究表明AR与MHC基因有关，HLA－B8、HLA－DR3、DR4、DR7、HLAQ2等可能与AR的发生有关［14］。但目前发现的易感基因并不能解释AR的所有遗传特征。

TAP为HLA－Ⅱ类区抗原处理相关基因编码的蛋白，属于ATP结合区(ATP－binding cassette，ABC)转运家族的 B族。TAP基因位于6p21.3，包括TAP1(ABCB2)和TAP2(ABCB3)基因，其编码产物是内质网膜上的跨膜二聚体，依赖ATP提供的能量TAP分子将细胞质及细胞核中经过蛋白酶复合体降解后产生的肽段转运到内质网腔中，与人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)I类分子结合，形成稳定的HLA－Ag复合物，然后表达于细胞表面并提呈给细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)［15－16］，产生特异的免疫应答。目前研究发现TAP分子是外源性抗原进入内源性通道的载体，TAP基因多态性可以影响抗原的选择和转运，从而改变免疫应答的类型，因而TAP的多态性在AR的发生发展中可能起重要作用［17－19］。已有较多研究证实，在变态反应病如特应性皮炎、支气管哮喘和自身免疫病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等疾病的发生发展过程中，TAP1的表达下调［20－21］，提示TAP1在此类疾病发生发展中可能起重要作用。

目前对TAP1基因多态性与AR的关系的研究报道较少，在AR发生中的作用仍有不同观点。Takheuchi等［22］报道日本人群AR与TAP1基因多态性无关。Yilmaz等［23］研究表明在土耳其AR患者的TAP1基因和健康对照组无差异。Ismail等［18］发现突尼斯人AR与TAP1－637位D等位基因高度相关。Izakovicová Hollá等［3］研究未发现捷克人特应症(变应性哮喘、AR、变应性接触性皮炎)与TAP1基因多态性有明显的相关性，但发现TAP1－333分布在病例组与对照组有明显差异(P＜0.02)。Kim等［24］研究表明TAP1基因与韩国人群患AR有关联。本研究表明，新疆汉族人群TAP rs12071480等位基因及基因型频率分布在AR组和对照组无统计学意义差异(P＞0.05)，提示TAP rs12071480可能不是新疆汉族患AR的易感基因。

检索NCBI的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)基因库，TAP1 rs2071480的原始等位基因(ancestral allele)为G，参考等位基因(refSNP alleles)为G/T，与本研究结果一致。根据本研究结果，新疆地区健康汉族人群TAP1 rs2071480等位基因及分布与数据库中其他地区及人群的分布有所不同，并且与内地汉族人群分布亦不同，见表3，差异有统计学意义(P＜0.05)。我们分析认为新疆地处西北，在长期历史条件下汉族人群与当地其他民族通婚并不罕见［25］，同时受新疆特殊的自然环境、气候以及饮食等诸因素影响，因而基因位点呈现不同于内地汉族人群的多态性分布。

基因多态性与疾病的关系受到广泛关注［26－27］。本研究未发现TAP1 rs2071480位点基因多态性与AR疾病易感性之间有关联，提示此位点可能不是新疆汉族人群患AR的易感基因。由于我们的样本量尚少，并可能有随机误差，并不能完全排除TAP1 rs2071480位点与AR易感有关。因此，有必要进一步扩大样本量进行验证，并进一步研究和探讨TAP1基因其他位点多态性与新疆汉族人群易患AR的相关性及AR可能的遗传易感机制。

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Relationship between TAP1*rs2071480 gene polymorphisms and allergic rhinitis in the Chinese Han population in Xinjiang

CHEN Qing－yong，YANG Yu－ping，XIANG Yang－bing，TAN Guo－ping，ZHANG Hua
(Department of Otorhinolaryngology，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumchi830054，Xinjiang，China)

Objective In recent years，more and more attention is being paid to the relationship between transporter associated with antigen processing 1(TAP1)rs2071480 gene polymorphisms and the susceptibility to allergic rhinitis(AR)，and the results vary in different studies.This study aims to investigate the association of TAP1*rs2071480 gene polymorphisms with the predisposition to AR in the Chinese Han population in Xinjiang. Methods We conducted a case control study on the region of TAP1*rs2071480 in 150 Chinese Han people with AR and 150 normal controls using the SNaPshot system. Results The frequencies of TAP1*rs2071480 were consistent with the Hardy－Weinberg equilibrium in both the case and the normal groups.The frequency distributions of three genotypes and two alleles showed no statistically significant differences between the two groups(P＞0.05). Conclusion Maybe TAP1* rs2071480 gene polymorphisms are not associated with the susceptibility to allergic rhinitis in the Chinese Han population in Xinjiang.

TAP1;Single nucleotide polymorphism;Allergic rhinitis;Han population

R765.21

A

1008－8199(2012)08－0805－05

国家自然科学基金项目(30860310)

830054乌鲁木齐，新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科［陈庆勇(医学硕士研究生)、阳玉萍、向阳冰、谭国萍、张 华］

张 华，E－mail:hzhang1106@yahoo.com.cn

2011－11－07;

2012－02－15)

(责任编辑:齐 名;英文编辑:罗永合)