固态发酵技术及其在农产品加工业废渣处理中的应用

赵国鹏，席北斗，夏训峰，魏自民 ，李鸣晓，李丹，刘东明

1.东北农业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030

2.中国环境科学研究院，北京 100012

我国是以农业为主的国家，农业生产中废弃物种类繁多、数量巨大［1］。农产品加工业废渣属于农业生产中的废弃物，主要包括果汁加工厂的果渣、果皮，食品加工行业的薯渣、蔗渣等［2］，是造成我国农村污染的因素之一。但是，这些废渣中含有大量蛋白质和纤维素等高有机质成分，是一种能够通过固态发酵(SSF)方式获得工业化生产相关产品的良好粗原料［3］，实际上是“叫错了名字、放错了位置的资源”。这些废渣的资源化与能源化利用越来越受到人们的关注。近年来许多学者对固态发酵农产品加工业废渣进行了广泛而深入的研究，Shojaosadati等［4］针对多床层固态生化反应器中的苹果渣发酵反应进行了研究，杨辉等［5］对固态发酵生产果胶酶的工艺进行了优化，而杨保伟等［6］则从菌种选育的角度对苹果渣固态发酵产柠檬酸进行了研究。大量研究者针对这些废渣从不同角度研究发现，最终均可获得有机酸、单细胞蛋白、酶等丰富的副产品，更进一步证明固态发酵技术可应用于农产品加工业废渣的处理中，并获得附加价值［7］。笔者对固态发酵技术及其工艺条件进行简要说明，重点介绍固态发酵技术在不同农产品加工业废渣处理中的应用，从而了解这些废渣固态发酵的研究进展及应用前景。

1 固态发酵及其过程工艺条件

1.1 固态发酵

固态发酵是在没有或者几乎没有自由水的固体基质上的发酵过程，但是其基质必须保有足够的湿度来支持微生物的生长和代谢，其固体基质既是微生物生长代谢所需的营养和能量来源，又能构成微生物生长的微环境系统。从生物反应过程的本质考虑，固态发酵是以气相为连续相的生物反应过程，适合好氧微生物的生长［8］。事实上，SSF再现了自然微生物的代谢进程，如堆肥与青贮，很适于微生物的生长代谢［9］。近年来，世界范围内关于SSF适宜底物的选择主要集中在农产品加工业废渣上［10］，并生产出许多高附加值的产品，如乙醇、单细胞蛋白(SCP)、酶、有机酸等［11-13］。表1列举了不同废渣及其生产的多种高附加值产品。

表1 固态发酵技术在农产品加工业废渣处理中的应用Table 1 Application of SSF in agro-industrial wastes

1.2 过程工艺条件

除了底物，SSF生产过程中还必须提供合适的发酵条件如温度、底物粒径和氧等［21］。

(1)温度

在SSF的各过程工艺条件中，温度最重要。由于微生物的生长繁殖和产物的合成都是在各种酶的催化下进行的，而温度是保证酶活性的重要条件。然而在发酵前期，微生物的生长和代谢会释放大量热量，这些热量如果不及时排除，菌体的生长和代谢会受到很大影响，严重时会导致菌体大量死亡，发酵彻底失败［22］。卫琳等［23］将温度恒定在30 ℃，固态发酵豆粕96 h，大豆肽转化率约为50%。刘天蒙等［24］将温度由米曲霉产酶的最适温度30℃升高为蛋白酶最适水解温度45℃，发酵72 h后，大豆肽转化率升至54.51%。因此，在SSF过程中必须保证稳定而合适的温度环境。

(2)底物粒径

底物粒径对于微生物的生长与活性起到重要作用，通常而言，物质颗粒越小会为微生物提供更大的附着表面积，而较大的粒径会保证良好的通风［25］。徐抗震对发酵苹果渣的粒径进行了研究，结果表明，苹果渣粒径对发酵效果有显著影响，粒径越小，果渣的分散越好，其营养物越有利于被微生物利用［26］。然而在固态发酵过程中，原料粒径过小会导致聚集结块，影响氧在基质内的传递，限制了微生物的生长［22］，因此SSF过程中底物的粒径要控制在合适的范围。

(3)氧

氧是构成细胞本身和代谢产物的组分之一，好氧微生物的生长发育、繁殖和形成代谢产物都需要消耗氧气，即氧也是一种特殊的发酵原料。因此，SSF过程中必须供给适量无菌空气，才能使菌体更好地生长、繁殖并积累所需要的代谢产物。为了防止基质内缺氧和增加基质内氧的浓度，促进微生物生长，通常采用通风、搅拌或翻动来增大氧的传递［21］。此外增加氧传递的常用方式还有:1)采用较薄的基质层;2)使用多孔的、较粗的利于氧传递的疏松性材料作基质填充料，如稻壳等;3)使用带孔的培养盘;4)采用低含水量的物料，中间补水［22］。

在工业应用中，要求通过控制条件来获得目的产品，因此，选择合适的过程工艺条件对SSF来说十分重要。但是，固态发酵的研究开发工作还很不够。虽然对固态发酵的适宜操作条件，反应器的开发等方面国外已有报道，但对该类发酵过程的反应动力学研究报道甚少。因此，深入探讨固态发酵过程的某些动力学特点，可为确定发酵过程的适宜操作条件和新型反应器的开发提供必要的理论依据。

2 固态发酵在不同农产品加工业废渣处理中的应用

固态发酵的研究趋势是培养基质多集中于农产品加工业废渣，而这些废渣的利用有助于解决环境污染问题。近年来，农业废渣的研究趋势是对其加以有效利用，并获得具有可再利用价值的产品，对甘蔗渣、苹果渣、马铃薯渣等的研究已有报道［14，27］，多为应用这些废渣生产饲料蛋白、有机酸、乙醇、酶等产物［4，28-29］。

2.1 苹果渣

2006—2007年全球苹果产量为4.61×107t，中国占 50%，达 2.45 ×107t［30］。其中，总产量的70%～75%直接供应市场，其余的25%～30%用于苹果汁、苹果酒及苹果干的产品加工。在果汁加工过程中，果汁回收率约为70%～75%，其余则为苹果废渣及苹果浆等废弃物［31］(图1)。表2列举了苹果渣干态和湿态的营养成分。从表2可见，苹果渣富含碳水化合物和其他重要的营养物，并具有较高的含水率(＞75%，湿态)和有机负荷，极易被微生物降解，繁殖细菌，滋生蚊蝇等害虫。若不加处置，会对环境造成极大危害，而且还导致纤维素和半纤维素资源的巨大浪费［26］。因此，这些果渣的开发利用迫在眉睫。国内外许多学者已对其固态发酵工艺条件及产物进行了大量研究，并获得相应目的产物——酶、饲料蛋白、有机酸等［32-36］。

图1 苹果渣和苹果浆废弃物的产生过程Fig.1 Generation of apple pomace and sludge waste

表2 苹果渣基本营养成分Table 2 Components in apple pomace

2.1.1 生产柠檬酸

柠檬酸是许多动植物代谢过程的中间产物，是一种重要的羧基酸［42］。虽然柠檬酸可以通过化学途径合成，但花费较高。一直以来柠檬酸都是通过接种曲霉Aspergillus niger等菌种进行液体深层发酵(SmF)来获得［43］，然而液体发酵受 pH、温度、微量金属离子等发酵条件的影响较大，为了降低成本、提高柠檬酸产量，SSF便以工艺简单、设备投资少的优点逐渐走上了生产柠檬酸的舞台。

利用苹果渣为主要原料并以固态发酵方式生产柠檬酸，既充分利用了果渣中丰富的还原糖、纤维素和半纤维素资源，变废为宝，又减轻了对环境的污染，而且开辟了柠檬酸生产的新途径。Kumar等［36］报道了利用果渣固态发酵生产柠檬酸的研究成果;Shojaosadati等［4］报道了在多床层固态生化反应器中，通过发酵生产参数的优化，柠檬酸产量达到124 g/kg(以果渣计)，且总糖的利用率可达到80%。在工艺方面，吴怡莹等［44］以苹果渣为原料固态发酵生产柠檬酸，通过正交试验得出产柠檬酸的最佳工艺条件:在500 mL锥形瓶中加入含水率40%的果渣15 g，接种量3 mL，混合菌种配比为1∶2，添加3%甲醇，30℃发酵5 d，柠檬酸产量最高可达78 g/kg(以果渣计)。而杨保伟等［6］则从菌种选育的角度对固态发酵苹果渣产柠檬酸进行了研究，值得一提的是采用经60Co-γ射线诱变后得到的正向突变株FG 23-13-3(γ)发酵苹果渣酶解液，柠檬酸产率最高可达 2.83 mg/mL，均高于现有研究报道［4，44］。这些研究都为苹果渣等废弃物找到了合适的出路，避免了大量废弃物的滞留，极大程度地为生态环境减小了负担。

以苹果渣为原料生产柠檬酸，在降低柠檬酸生产成本的同时，得到了经济效益，更丰富了柠檬酸生产原料的种类，具有极为广阔的发展前景。

2.1.2 生产饲料蛋白

通常所言的饲料蛋白即单细胞蛋白，又称微生物蛋白或菌体蛋白，是指酵母菌、真菌、非病性细菌等单细胞生物体内所含的蛋白质，其中各种氨基酸搭配合理、种类齐全，且维生素和微量元素含量丰富，这些都是农作物饲料所不能比拟的［45-46］。近年来，随着环境危机、资源危机的出现，饲料蛋白的研究和开发受到各国科研工作者和工业生产者的广泛关注。

苹果渣以其投资少、效益好、发酵工艺简单为主要优势，且能生产出蛋白含量高，氨基酸和维生素含量丰富，营养价值高的饲料蛋白产品，不仅解决了废渣的处理问题，而且扩大了饲料蛋白的生产来源。图2为苹果渣固态发酵产饲料蛋白工艺流程。

图2 苹果渣固态发酵产饲料蛋白工艺流程Fig.2 Process flow of feeding protein production from apple pomace

对苹果渣固态发酵生产饲料蛋白的研究比较丰富，从发酵菌种的筛选、菌种配比到发酵条件等方面都有较深入的研究。陈松等［47］对已有产朊假丝酵母、黑曲霉、白地霉、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母等菌株应用平板刺激圈法和固态发酵测定蛋白质含量的方法进行单菌初筛和复筛，得到适合苹果渣发酵的菌种。在此基础上进行混菌培养，得到适合的菌种搭配。徐抗震等［16］以苹果渣自身组分为基础，从不同菌株的功能作用出发，对苹果渣进行混合菌种发酵，并最终对复合菌种混合配比进行了研究，从而得出四个菌种最佳质量比(产朊假丝酵母∶绿色木霉∶果酒酵母∶康宁木霉为 1.5∶1∶8∶2)。在此基础之上，徐抗震等［48］继续进行了深入研究，比较了接种量、pH、发酵温度、发酵时间以及非蛋白氮和无机盐的加入形式、灭菌等发酵条件对发酵结果的影响，确定了苹果渣固态发酵生产饲料蛋白工艺。Roussos等［33-35］也以相同的原料制备出了饲料蛋白，得出经发酵后的苹果渣，粗蛋白等主要成分含量显著提高，发酵产物纯蛋白增加了33.3%。

2.1.3 生产果胶酶

果胶酶(Pectinase)是分解果胶质的一类酶的总称，是世界四大酶制剂之一［49］，在环境保护、食品加工、饲料加工、造纸、诱导植物抗病等方面都有很高的应用价值。目前发酵生产果胶酶的原料主要是制糖工业剩余的甜菜渣，由于我国农业结构调整导致甜菜渣短缺以及市场对果胶酶需求量的增加，开辟新的果胶酶原料来源势在必行。苹果渣内含有丰富的还原糖、纤维素和半纤维素等，因此利用苹果渣固态发酵生产果胶酶是可行的［32］，同时为果胶酶的生产原料及苹果渣的综合利用开辟了新的途径。

苹果渣固态发酵生产果胶酶的工艺流程如图3所示。

图3 苹果渣固态发酵产果胶酶工艺流程Fig.3 Process flow of pectinase production from apple pomace

杨辉等［5］对以苹果渣为主要原料固态发酵生产果胶酶的工艺进行了优化，酶活力达到174.54 U/mL;田林茂等［17］从菌种的选择入手，采用适合在苹果渣上生长的果胶酶高产菌株黑曲霉HG-1，以苹果渣为主要原料进行固态发酵生产果胶酶，其产品具有较高的酶活力，达到22248 U/g，高于同类报道［50］。

2.2 甘蔗渣

甘蔗渣是一种纤维质含量丰富的农业副产品，其纤维素所占比例达50%，半纤维素和木质素所占比例分别为25%左右［51］。甘蔗渣作为纤维素废弃物，是一种可再生能源和初等原材料，因此利用纤维素废弃物通过有效方法生产能源具有重大意义和发展前景。由于甘蔗渣与稻杆、麦秆相比粗灰分含量较低，因此可用于接种微生物的固态发酵之中。

2.2.1 生产乙醇

随着地球上不可再生资源日益消耗，用天然木质纤维素如甘蔗渣等转化得到乙醇等能源将成为当前研究的热点［52］。巴西在20世纪80年代开发的用甘蔗渣生产酒精的技术居世界领先地位，运用新技术可从每t甘蔗渣中提取109～180 L酒精，使甘蔗的酒精产量由7740 L/hm2提高到13800 L/hm2，无需扩大甘蔗的种植面积就可使酒精的产量(2003—2004年度为1.48×1011L)增加1倍，成本降低40%［53］。在我国也已有学者对固态发酵甘蔗产乙醇进行了研究，探讨了甘蔗颗粒的大小、发酵温度、含水率等因素对发酵速率的影响，提出甘蔗固态发酵适宜的操作条件，并阐述了其动力学特性［18］。

2.2.2 生产有机酸

Soccol等［54］对甘蔗渣产乳酸进行了液体和固态发酵的对比研究，在试验中保持葡萄糖浓度为120和180 g/L，液体发酵和固态发酵分别产生93.8和137.0 g/L的L(+)-乳酸，产率分别为1.38和1.43 g/(L·h)，固态发酵有较好的表现，为甘蔗渣生产有机酸的研究拓宽了道路。Kianoush［55］用经尿素处理后的甘蔗渣为原料，目标产物是柠檬酸，研究尿素预处理对柠檬酸产量的影响，结果表明，柠檬酸产量可达137.6 g/kg(以干物质计)，并在此基础上扩大试验规模，产酸浓度与酸产量分别达到82.38 g/kg和 26.45 g/(kg·d)。

2.2.3 生产单细胞蛋白

单细胞蛋白通常是利用易降解高有机质物质合成的，然而甘蔗渣作为一种高纤维素废弃物亦可生产单细胞蛋白。徐雅飞［56］通过研究甘蔗渣生产饲料蛋白，确定了生产工艺，得到的饲料产品分别含有9.21%的可溶性还原糖、25.45%的蛋白质和7.46%的游离氨基酸，蛋白质和游离氨基酸含量分别比原料培养基提高了81.40%和83.24%;粗纤维含量从原来的43.95%降为21.71%，降解率达50.60%。吴谦等［57］利用混合培养技术以甘蔗渣为唯一碳源生产单细胞蛋白质，结果表明，甘蔗渣在未经任何处理的情况下，32℃振荡培养108 h，发酵产物中粗蛋白浓度为260 g/kg。

2.3 马铃薯渣

我国是世界上最大的马铃薯种植生产国，总产量占世界马铃薯总产量的20%左右，居世界第一［58］。但长期以来，由于技术水平的限制以及缺乏综合利用意识，造成大量副产物如薯皮、薯渣等滞留，破坏生态环境的同时又使潜在资源未得到有效利用，为此，国内外的许多科研人员开展了大量的研究。近年来，固态发酵技术以其消耗低、成本低、工艺简单的优势越来越多的应用到马铃薯渣的资源再利用之中，并在饲料蛋白的生产方面取得了一定的成就。

2.3.1 生产饲料蛋白

对于马铃薯渣固态发酵的研究，多集中于饲料蛋白的生产，且对其发酵工艺的研究较多［14，28，59］。

贠建民等［59］通过对工艺的研究使得多菌协生发酵产物的真蛋白含量有了较大的提高，由发酵前的4.08%提高到16.52%，增幅12.44%。赵凤敏等［28］研究了发酵培养基的最佳组成与配比并确定了生产工艺，结果表明，发酵产品氨基酸种类齐全，营养价值提高，安全性得到保证。Gélinas等［14］用薯条加工厂废水中的马铃薯淀粉作为固态发酵的培养基质进行蛋白质的富集，在6株已筛得菌株基础上选用最适菌种Candida utilis ATCC 9256，并继续扩大规模进行固态发酵试验，得到12%的蛋白，其中包括8%的酵母蛋白，从而为大规模进行蛋白饲料的生产奠定基础。

2.3.2 生产生物杀虫剂

马铃薯渣可作为固态发酵底物生产昆虫致病性的菌类孢子，如Beauveria bassiana。将马铃薯渣底物置于28℃培养10 d，孢子产量为3.92×109个/g(以干物质计，下同)，在此基础上，通过培养条件的优化，孢子的最大产量为3.0×1010个/g，活性可达87%［15］。说明马铃薯等农产品加工业残渣可用作生物杀虫剂的生产。

2.4 其他废渣

2.4.1 生产酶

Ajay等［19］利用麦麸和大豆饼粕为原料，接种Aspergillus niger DFR-5菌种经固态发酵获得木聚糖酶，最高活性可达 2596 U/g(以干物质计)。Krishnan等［20］以麦麸和油渣饼为底物，接种Mucor racemosus NRRL 1994进行固态发酵，得到了植酸酶。还有学者利用茶叶废弃物经固态发酵生产得到较高活性的葡糖淀粉酶［60］。Jose等［61］通过研究使蓖麻子废渣脱毒，并接种Paecilomyces variotii菌种固态发酵，能同时生产鞣酸酶、植酸酶，其最高活性分别可达2600和260 U/g。

2.4.2 生产饲料蛋白

葡萄渣中蛋白质仅占10%左右，纤维素、木质素等含量丰富，不易被动物吸收，故作饲料营养价值偏低，而且适口性差。林清华等［62］以葡萄渣为唯一碳源，采用固体发酵混合培养技术进行生产饲料蛋白的试验，结果表明，未灭菌的培养基，以尿素为氮源，含水率为60%，28～30℃培养48 h，发酵产物的粗蛋白含量可提高1倍。陈洪伟等［63］以麸皮为底物，利用酵母菌和黑曲霉混合菌株固态发酵生产饲料蛋白，并通过正交设计确定了最优发酵条件，培养温度30℃、接种量为10%、接种酵母菌Ⅱ和黑曲霉Ⅰ(质量比为 2∶1)、水料比为 1∶1、葡萄糖添加量2%，所得产物中粗蛋白占25.26%，比麸皮发酵前提高了33.93%。

2.4.3 生产柠檬酸

Imandi等［64］以菠萝渣为唯一碳源，接种Yarrowia lipolytica NCIM 3589，采用固态发酵法生产柠檬酸，并将统计学的方法与培养基组分的优化相结合，确定的最佳搭配条件:接种量0.34%，含水率70.71%，KH2PO40.64%和 Na2HPO40.69%，在此条件下柠檬酸产量可达202.35 g/kg(以干物质计)。

3 结论与展望

不同的农产品加工业废渣的物理结构和化学成分存在差异，但都具有可再利用的营养价值和潜在的经济效益。固态发酵技术可很好地实现这些废渣的处理处置，同时能获得较高附加值的目标产物，具有广阔的应用前景。然而在实践中，其反应器种类多为实验室规模的锥形瓶，与稍具规模的生物反应器及大型发酵装置结合的试验开展得并不充分(尤其在我国)。而且对固态发酵研究较多的仍为工艺的优化，对于固态发酵内部的过程动力学机理涉及不足，须经数学模型的研究和发展，不断解释固态发酵过程变化规律，加之与设备的结合及系统控制技术的完善，才会充分实现废弃资源的再次利用、深度利用的工业生产。因此，固态发酵农产品加工业废渣的未来发展方向是自动化、规模化、工业化。

我国是个农业大国，我们的农业科技实力不应仅仅停留在废弃物的再利用层面，而应更深层次地体现在废弃物生产高附加值功能产品的开发上，提高我国农业科技在世界范围内的竞争力。利用微生物固态发酵转化农产品加工业废渣生产高附加值功能产品，具有能耗少、成本低、废液少，不存在二次污染等突出优点。通过合理优化发酵条件及控制反应过程，既可减少资源浪费，又能得到结构优异且活性优良的代谢产物，如各种有机酸、代谢酶、单细胞蛋白等，其巨大的生态效益与经济价值，使得利用固态发酵技术处理农产品加工业废渣进行大规模生产成为可能，尤其在能源危机和环境问题日益突出的今天，固态发酵作为一种绿色的生产工艺，将会在环境保护中发挥越来越重要的作用。

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