手机微波辐射对豚鼠耳蜗外毛细胞膜电位的影响△

冯晓华 龙孝斌 汪建 陈勇挺

目前，手机通讯已成为人们信息交流的主要工具之一，其电磁微波辐射可能对人们的健康构成潜在的威胁。近年来，手机微波辐射对大脑及中枢神经系统可能产生的影响备受研究者关注［1］。本研究拟通过建立模拟手机微波辐射豚鼠模型，分离豚鼠单个活的耳蜗外毛细胞（outer hair cell，OHC），在2 000Hz不同强度的纯音刺激下，观察单个离体豚鼠耳蜗OHC膜电位的变化及规律，探讨手机微波辐射对听觉功能可能产生的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选用成年健康杂色豚鼠20只，体重280～350g，雌雄不分，耳廓反射正常，由南方医科大学实验动物中心提供。豚鼠适应性喂养10天后，随机分为对照组、辐射组，每组各10只。

1.2 检测仪器 ACAS 570 粘附式细胞仪（美国Meridian公司生产）；丹麦产Madson纯音测听仪；DIBAC4（3）荧光探针（美国Sigma公司产品，细胞膜特异性荧光探针）。

1.3 手机微波辐射装置及辐射方法 手机通信频率为900 MHz，功率密度为0.05 mW／cm2。将辐射组豚鼠限制于自制的笼中，将手机听筒放置于豚鼠的耳部，距离豚鼠耳廓2cm，以便及时调整并模拟人通话的状态。接通手机后辐射时间分别为1、6、12、24和48h（各2只豚鼠），对照组豚鼠除不进行手机辐射外，其余处理均与辐射组相同。

1.4 实验溶液的配制

1.4.1 Hepes 液的配制（mmol／L） NaCl 133，KCl 5.4，Hepes 5，Glucose 5，CaCl21.3，MgSO40.9，配制时准确称量后采用三蒸水配制，用1N 的NaOH 调节pH 至7.4，4mol／L NaCl将其渗透压调节为300mmol／L。

1.4.2 IV 胶原酶液的配制 采用美国Sigma公司生产的IV 胶原酶，用Hepes液配制成浓度为0.5 mg／ml备用。

1.4.3 多聚赖氨酸粘附剂的配制 采用美国Sigma公司生产的多聚赖氨酸（poly－1－lysine），用三蒸水配制成0.25mg／ml溶液，取50μl加入ACAS 570专用培养皿中，无菌条件下风干备用。

1.4.4 DIBAC4（3）荧光探针的配制 取DIBAC4（3）25μl（1mg／ml）加入Hepes液至10ml即成5 μM 液，避光冷藏备用。

1.5 OHC的分离及染色 在5个不同的时间点分别随机活杀两组中的2只豚鼠，于2分钟内取出听泡，浸于Hepes液中，在解剖显微镜下分离出第2～4回基底膜，用微量加样器吸取分离出的基底膜于玻璃试管中，加入等量的0.5 mg／ml IV 胶原酶（Sigma，用Hepes液配制，终浓度为0.25mg／ml），轻轻吹打5次，静置10分钟后用Hepes液洗涤3次；微量加样器加入5μM 的DIBAC4（3）避光染色20分钟；离心去除上清液。吸取50μl细胞悬液加入含有薄层多聚赖氨酸的特制培养皿中（Sigma，用三蒸水配成0.25mg／μl，50μl加入培养皿中，无菌风干备用），静置5分钟。将培养皿置于ACAS 570载物台上，显微镜下选取活性良好的OHC［2］进行检测。

1.6 OHC膜电位的检测 选取活性良好的OHC，在静息状态下先扫描40秒后，将纯音测听仪输出耳机距培养皿约10cm 高，由上而下对准培养皿底部，采用2 000Hz纯音，分别于扫描第40、70、100、140、170、200、225、240 及275s时予10、20、30、40、50、60、70、80及100dB HL纯音刺激，每次持续3s，于100dB HL 时持续刺激60s，观察OHC 内荧光值的改变。上述实验于室温下（20～25 ℃）1小时内完成，以确保OHC的良好活性。

1.7 统计学方法 实验数据均采用SPSS13.0软件包进行统计分析。豚鼠的离体单个OHC 首次声刺激的去极化时间、首次去极化膜电位水平（荧光值）采用±s表示；对照组和辐射组之间的比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 静息状态下离体OHC荧光值特征 DIBAC4（3）为一种亲阳离子的阴离子染料探针，其跨膜分布依赖于膜电位。在静息状态下OHC 呈现试管状，DIBAC4（3）均匀、无规则分布于整个细胞质中，胞浆的两极相对集中，周边较弱（图1、2）。

2.2 对照组OHC膜电位变化规律 对照组豚鼠的离体单个OHC 在2 000 Hz不同强度纯音刺激下，细胞内荧光强度呈不同程度的增高（曲线上升），而刺激间歇时，细胞内荧光强度亦开始回落（曲线下降），伴随声刺激的持续和间断，曲线亦呈现上升、下降、再上升和再下降之变化规律，即OHC 产生去极化、复极化、再去极化和再复极化改变。图3提示：予2 000Hz、10dB HL 纯音声刺激OHC 时，第40 s细胞内荧光值开始升高，并于第50s达到峰值（1.112u），随后细胞内荧光值开始回落，于第60s至最低值（1.000u）。表明对照组OHC 首次去极化时间为10s，并于10s内完成复极化。

2.3 辐射组OHC 膜电位变化规律 辐射组手机微波辐射后1 小时检测结果表明，予2 000 Hz、10 dB HL纯音刺激OHC时，第40s细胞内荧光值亦开始升高，第65s达到峰值（1.100u），随后细胞内荧光值开始回落，至第二次声刺激（第70s、20dB HL）开始时回落至1.045u。以后连续3次声刺激时曲线有微上升，但都未能达到峰值和完全回落，提示手机微波辐射1小时后，OHC细胞膜的去极化和复极化时间明显延长且不能完全去极化和复极化（图4）。辐射6小时和12小时后，随着间断的声刺激可见OHC内荧光值缓慢上升，辐射6 小时组之毛细胞于第70s荧光值达峰值（1.100u），而辐射12小时组之毛细胞于第90s荧光值达峰值（1.050 u），随后整条曲线呈微上升趋势（图5、6）。辐射24和48小时后，经过声刺激，曲线呈微上升、微下降波动，无明显峰值及回落（图7）。提示经手机微波连续辐射24小时后，OHC无明显去极化和复极化过程。

2.4 首次声刺激OHC 膜电位荧光峰值变化规律 手机微波辐射1、6、12、24和48小时后，离体豚鼠OHC首次声刺激后膜电位荧光峰值较对照组显著降低（P＝0.000，P＜0.01）。辐射后1小时和6小时两组相比较，OHC首次声刺激后的膜电位荧光峰值水平差异无显著统计学意义（P＝0.129，P＞0.05），且OHC膜电位荧光值水平均为1.00u（图4，5）。随辐射时间的延长，首次声刺激后OHC 膜电位荧光峰值水平逐渐下降，辐射时间越长，下降越明显。

2.5 首次声刺激OHC 去极化时间变化规律 手机微波辐射1、6、12小时后，OHC 首次去极化时间较对照组显著延长（P＝0.000，P＜0.01）；随着辐射时间的延长，OHC去极化时间明显延长，辐射12小时后，去极化时间最长；辐射后各组与对照组比较差异均有显著统计学意义（P＝0.000，P＜0.01）；辐射24和48小时后，膜电位仅呈轻微、不规律的波动，没有明显的去极化过程（表1）。

表1 首次声刺激后各组OHC膜电位荧光峰值和去极化时间（膜电位水平）（±s）

表1 首次声刺激后各组OHC膜电位荧光峰值和去极化时间（膜电位水平）（±s）

组别膜电位的荧光值（u）去极化时间（s）1.112±0.002 9.92±0.16辐射组 辐射1小时1.087±0.116 24.97±0.18 辐射6小时1.081±0.014 30.49±0.98 辐射12小时1.046±0.003 50.00±1.27 辐射24小时1.021±0.007— 辐射48小时1.021±0.007对照组—

图1 静息状态下对照组离体OHC形态及DIBAC4（3）荧光分布图2 静息状态下辐射组辐射1h离体OHC形态及DIBAC4（3）荧光分布图3 2 000Hz声刺激后对照组OHC荧光值变化曲线

图4 2 000Hz声刺激后辐射1h组OHC荧光值变化曲线图5 2 000Hz声刺激后辐射6h组OHC荧光值变化曲线图6 2 000Hz声刺激后辐射12h组OHC荧光值变化曲线图7 2 000Hz声刺激后辐射24、48h组OHC荧光值变化曲线

3 讨论

手机电磁辐射属于微波波段，频率为800～2 000 MHz。手机微波辐射能量以脉冲式重复递增，其频率高、波长短，对生物体的影响较大。目前使用最为普遍的手机是采用全球定位系统的数字手机，中心频率为900 MHz，通过微波的微小调制来传输语音信息。有研究者［2］发现，电磁辐射对人体的作用主要是非热效应，并指出这与神经系统方面的异常表现有关，电磁辐射对儿童的免疫功能和神经系统影响更为突出。Monfrecola等［3］用手机辐射志愿者的耳部，然后测定皮肤的血流量，发现手机辐射组的血流量较对照组显著升高。Moustafa等［4］试验表明暴露于手机辐射场中1、2、4小时后，血浆中油脂过氧化物水平显著增高，自由基清除剂超氧化物歧化酶活性显著降低。有实验室采用大白鼠模型来研究手机辐射的促癌作用，结论认为长时间、高频率使用移动电话能提高诱发脑部恶性肿瘤的风险，并且颞叶的肿瘤尤为明显，其中又以听神经瘤的患病风险最高［5］。使用手机时通常是靠近或紧贴耳部，因此听觉系统被认为是最有可能受到影响的器官之一［6］。

耳蜗OHC的运动可增强基底膜振谐曲线对特征频率的敏锐度，对内毛细胞有驱动效应作用，并间接影响内毛细胞对振动刺激信号的敏感性。这表明OHC及其膜电位在人类听觉生理中具有重要作用，其生理功能状态对听觉功能有直接的影响。当耳蜗受到声刺激时，在耳蜗及其附近结构可记录到一种特殊的电波动，通常称之为微音电位［7］，这是一种由声刺激诱发的、起源于许多OHC 且存在于细胞外的感受器交流总和电位，耳蜗微音电位主要来源是OHC（占80%～85%），而小部分来源于IHC（15%～20%）［8］。电阻调制学说认为毛细胞顶部的膜内、外存在着约140mV 的巨大电位差，OHC 膜可能起着一个可变电阻器的作用，其阻值随着听纤毛向不同方向的弯曲和复位而增大或减少，造成膜电阻的相应波动，在膜两侧形成一个波动式的电压变化，对原有的毛细胞静息电位（－60 mV）和内淋巴电位（＋80mV）进行调制。当耳蜗毛细胞受到机械刺激兴奋后，产生耳蜗微音电位，传入神经的谷氨酸递质释放激活钙离子通道，引起蜗神经末梢兴奋产生动作电位，上传至大脑皮层产生听觉［8］。OHC膜电位的大小及变化决定了微音电位的大小及变化规律［9］。本研究中OHC膜电位改变的机理可能是微波辐射引起OHC 的钙通道激活，使得钙离子通透性增加并通过OHC 的胞膜内流，使钠－钙交换受到抑制，胞内钙离子的增加改变了OHC 的膜电位和能动性。

耳蜗的听觉过程是一个从机械刺激到发放神经冲动的环节，耳蜗向听觉中枢提供精确的听觉信息，使中枢对听觉信息进行精细处理并对听敏度起着关键的作用。本实验采用ACAS 570粘附细胞仪、DIBAC4（3）荧光探针为检测手段，以2 000Hz不同强度纯音刺激作用于离体状态下活OHC，动态观察OHC膜电位的变化规律。ACAS 570 为粘附式细胞分析及筛选激光显微镜，具有高分辨率，可用于活细胞的功能研究，如细胞内染色体、pH 值、离子浓度和膜电位测定等。DiBAC4（3）是一种膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料，该染料于去极化时进入细胞，细胞内荧光强度增加；复极化时从细胞内移出，细胞内荧光强度降低。根据其在细胞内、外的重新分布，可判断出细胞膜电位的变化［10］。本实验中DiBAC4（3）荧光值与膜电位的对应关系为：第40s予2 000Hz、10dB HL 纯音刺激OHC 时，细胞内荧光值开始升高，第50s达到峰值（1.112u），刺激间歇期细胞内荧光值开始回落，第60s至最低值（1.000u），即OHC完全去极化时之膜电位所对应的荧光值为1.112u，而完全复极化时膜电位所对应的荧光值为1.000u。本实验结果提示：当予2 000Hz不同强度纯音声刺激对照组OHC 时，OHC产生规律性的去极化、复极化、再去极化和再复极化改变；手机微波辐射1小时后，OHC 细胞膜的去极化和复极化时间明显增加，并且不能完全去极化和复极化；辐射时间超过6小时后，伴随声刺激曲线呈微上升、微下降波动，无明显峰值及回落。提示手机微波连续辐射6小时后，OHC无明显去极化和复极化过程，去极化的峰值明显降低，动作电位产生的峰值也降低；当辐射时间大于24h时，声刺激后OHC基本不能出现膜电位变化。产生此结果的原因可能是由于手机微波辐射改变了OHC 膜表面的跨膜蛋白结构，并进而影响OHC 膜离子通透性及跨膜电位的形成［11］。

综上所述：长时间的手机微波辐射能引起离体豚鼠耳蜗OHC膜离子通透性的改变，影响OHC膜电位的形成及细胞去极化、复极化，从而导致离体OHC膜电位对不同强度纯音刺激的敏感性逐渐降低。至于手机微波辐射如何改变以及改变何种离子通透性，则有待进一步实验研究。本实验不足之处是，2 000Hz不同强度纯音刺激由空气介质进入水溶液介质时，将产生一定的折射损耗，作用于OHC的刺激强度有所减弱。因此，应进一步改进实验方法和手段，以获得更加接近于生理状态下的实验结果。

1 Galloni P，Lovisolo GA，Mancini S，et al.Effects of 900 MHz electromagnetic fields exposure on cochlear cells＇functionality in rats：evaluation of distortion product otoacoustic emissions［J］.Bioelectromagnetics，2005，26：536.

2 Hyland GJ.Physics and biology of mobile elephony［J］.Lancet，2000，356：1833.

3 Monfrecola G，Moffa G，Procaccini EM.Non－ionizing electromagnetic radiations，emitted by a cellular phone，modify cutaneous blood flow［J］.Dermatology，2003，207：10.

4 Moustafa YM，Moustafa RM，Belacy A.Effects of acute exposure to the radiofrequency fields of cellular phones on plasma lipid peroxide and antioxidase activities in human erythrocytes［J］.J Pharm Biomed Anal，2001，26：605.

5 Lonn S，Ahlbom A，Hall P，et al.Mobile phone use and the risk of acoustic neuroma［J］.Epidemiology，2004，15：653.

6 Parazzini M，Tognola G，Franzoni C.Modeling of the internal fields distribution in human inner hearing system exposed to 900and 1 800MHz［J］.IEEE Trans Biomed Eng，2007，54：39.

7 Maguin K，Campo P，Parietti Winkler C.Toluene can perturb the neuronal voltage－dependent Ca2＋channels involved in the middle－ear reflex［J］.Toxicol Sci，2009，107：473.

8 李兴启，孙建和，杨仕明，等.耳蜗病理生理学［M］.北京：人民军医出版社，2011.79～153.

9 Peleg U，Perez R，Freeman S.Salicylate ototoxicity and its implications for cochlear microphonic potential generation［J］.J Basic Clin Physiol Pharmacol，2007，18：173.

10 Yamda A，Gaja N，Ohya S，et al.Usefulness and limitation of DiBAC4（3），a voltage sensitive fluoresent dye for t he measurement of membrane potentials regulated by recombinant large conductance Ca2＋actived K＋channel in HEK293cells［J］.J Pharmacol，2001，86：342.

11 Zheng J，Shen W，He DZ.Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells［J］.Nature，2000，405：149.