马钱子优化总生物碱的制备与评价

李 俊 严道南

南京中医药大学，江苏南京 210046

传统大毒中药马钱子，又名番木鳖，是马钱科植物马钱（Strychnou nux-vomica L.）的干燥成熟种子，最早的记载见于《本草纲目·卷十八》，药理学研究表明其具有消肿止痛、抗炎、抗肿瘤等药理作用，因此，在中医药临床上得到广泛应用，可用于治疗风湿痹痛、面神经麻痹、肿瘤等疾病。

实验研究证实马钱子中的总生物碱为其主要有效成分，而总生物碱中又含有至少16种的生物碱成分[1]，其中马钱子碱和士的宁为其主要成分，两者的含量分析多以单独进行[2-3]，研究表明两者的总含量约占总生物碱的一半。其中，士的宁的毒性是马钱子碱的45～71倍[4-5]，且药效学研究表明其在消肿止痛方面几乎没有活性[6]，因此，本文利用的宁和马钱子碱在50%乙醇中溶解度相差悬殊的原理除去马钱子总生物碱中大部分士的宁，从而得到马钱子优化总生物碱，并进行了成分分析、安全性与药效评价，对于具有高度安全性的马钱子制剂的开发无疑具有重要的意义。

1 仪器与试药

1.1 仪器

日本岛津LC-20A高效液相色谱仪；AS1201自动进样器（大连依利特分析仪器有限公司）；UV2800AH紫外分光光度计（优尼柯仪器有限公司）；BS124S电子分析天平（德国赛多利斯公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；循环水式真空泵，型号SHZ-D（Ⅲ）（巩义市予华仪器有限责任公司）；PHS-3C PH计（上海雷磁公司）；真空干燥箱，型号DZF-6020（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 试剂

本实验中所使用的马钱子为浙江中医药大学中药饮片厂生产（生产批号：20090219），经南京中医药大学蔡宝昌教授鉴定证实为马钱科植物马钱（Strychnos nux-vomica.L.）的干燥成熟种子；士的宁对照品（中国药品生物制品检定所），马钱子碱对照品（中国药品生物制品检定所）；乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司），其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

ICR小鼠，许可证号：SCXK（苏）2007-0001，雌雄各半，体重18～22 g，购自扬州大学比较医学中心。

2 方法与结果

2.1 马钱子总生物碱的提取与纯化

称取生马钱子粉末50 g，过50目筛，以15倍量的70%乙醇回流提取半小时，共重复操作3次，合并3次所得滤液，用旋转蒸发仪将滤液真空干燥浓缩至干粉末状，取1 mol/L盐酸100 mL将粉末溶解，以4 000 r/min离心10 min，取得上清液，用40%NaOH将pH调整为12，用二氯甲烷萃取后合并二氯甲烷萃取液，真空干燥并精密称重，得到马钱子总生物碱，得率为（3.11±0.33）%（n=5）。

2.2 马钱子优化总生物碱的制备

称取马钱子总生物碱粉末共100 mg，用60 mL 50%乙醇将粉末溶解，置于真空干燥箱中浓缩，烧瓶内壁上可见大量白色结晶析出，取浓缩液水浴继续浓缩至原体积的8%后，4 000 r/min离心10 min，倒出上清液，4℃冰箱中静置过夜，4 000 r/min离心20 min后弃沉淀，取得上清液置于真空干燥箱中60℃真空过夜，精密称重，得到优化马钱子总生物碱，得率为（43.85±0.33）%（n=5）。

2.3 马钱子优化总生物碱的成分分析

2.3.1 酸性染料比色法测定纯度[7]

磷酸氢二钠1.681 8 g，磷酸二氢钠0.315 1 g，用水溶解，定容至100 mL得pH 7.2磷酸盐缓冲液。取pH 7.2的磷酸盐缓冲液，溶解溴麝香草酚蓝12.5 mg，定容至50 mL得显色液。

分别取马钱子优化总生物碱和马钱子碱适量，以氯仿定容，配制为0.10 mg/mL的氯仿溶液，制备供试液与对照品溶液。

取氯仿样品溶液和对照品溶液各0.5 mL至锥形瓶，60℃真空干燥，加入4 mL显色液，涡旋1 min，再加入6 mL氯仿，涡旋2 min，移至分液漏斗，静置4 h后将氯仿层放出，倒入比色皿中进行比色测定，检测到波长为416 nm，平行3份测定。另取0.5 mL氯仿作为空白对照，同法操作。以测得的马钱子碱计的总生物碱含量除以称重含量计算纯度（%）。结果表明，制得的马钱子优化总生物碱以马钱子碱计，其纯度为（100.66±1.84）%（n=3）。说明所制得的马钱子优化总生物碱的纯度很高。

2.3.2 HPLC法测定马钱子碱与士的宁的含量

根据王绚等[8]的研究比较结果，本实验选择高效液相色谱法（HPLC）来测定马钱子碱与士的宁的含量。

2.3.2.1 色谱 条 件KromasilC18（4.6mm×250mm，5μm），流动相：pH 2.8酸水（含0.02 mol/L磷酸二氢钾与0.01 mol/L庚烷磺酸钠等量混合溶液，用10%磷酸调节pH到2.8）∶乙腈=76∶24，流速：1 mL/min，检测波长：264 nm，进样量：10μL，柱温：40℃。

2.3.2.2 对照品溶液和供试品溶液的制备 按《中国药典》2010年版一部所述方法，各称取马钱子碱对照品10 mg、士的宁对照品10 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加氯仿溶解定容。各取0.1 mL，用甲醇稀释至5 mL于同一5 mL容量瓶中，摇匀即得对照品溶液和供试品溶液，其中每1毫升含马钱子碱20μg和士的宁20μg。用氯仿将马钱子优化总生物碱溶解配制成10 mg/mL溶液，取适量用甲醇稀释、定容到25μg/mL，进样分析。按《中国药典》2010年版方法，以对照品和供试品相应色谱峰面积值，采用外标一点法进行定量。色谱见图1，测定结果见表1，可见优化后士的宁的含量显著下降，马钱子碱与士的宁的比例为2.7∶1。

图1 HPLC色谱

2.4 马钱子优化总生物碱的急性毒性研究

小鼠18～22 g，雌雄各半。受试药物为马钱子总生物碱和马钱子优化总生物碱，给药途径为尾静脉注射。通过预实验确定100%死亡组剂量Dm和0死亡组剂量Dn，马钱子优化总生物碱组在Dm（9 mg/kg）和Dn（1.575 mg/kg）的剂量范围内设4个剂量组，分别为2.161、3.087、4.410、6.300 mg/kg（剂量等比级数1∶0.7）。马钱子总生物碱组在Dm（1.60 mg/kg）和Dn（0.272 mg/kg）的 剂 量 范 围 内 设4个 剂 量 组，分 别 为0.385，0.549，0.784，1.120 mg/kg（剂量等比级数1∶0.7）。每个剂量组10只小鼠。按Bliss法计算的实验结果见表2。可见，优化后马钱子总生物碱的毒性显著下降，LD50比优化前提高了4.8倍。

表1 马钱子总生物碱优化前后的含量对比（±s，%，n=3）

表1 马钱子总生物碱优化前后的含量对比（±s，%，n=3）

成分 含量马钱子碱优化前优化后24.02±2.12 51.60±1.44士的宁优化前优化后43.38±3.77 18.94±1.30

表2 马钱子总生物碱优化前后的急性毒性实验结果比较

2 .5马钱子优化总生物碱的抗炎作用评价

精密称取马钱子总生物碱（马钱子碱与士的宁含量比为1∶2）、马钱子碱、优化马钱子总生物碱（马钱子碱与士的宁含量比为1.8∶1）适量，用含20 %乙醇的PBS（pH＝7.4）溶解，浓度为1 mg/mL。

2.5.1 分组

实验小鼠随机分为7组，每组10只。分别为空白对照组；阳性组（云南白药酊）；马钱子总生物碱组；马钱子碱组；优化马钱子总生物碱高、中、低剂量组。

2.5.2 给药方案参照文献[9]

于小鼠右耳涂抹20μL二甲苯，左耳作为对照不涂二甲苯，30 min后，于各组小鼠左右两耳涂抹相应的受试药物，空白组给予含20%乙醇的PBS，给药组给予优化马钱子总生物碱，一共涂抹药物3次，每次为80μL，间隔10 min，最后1次给药40 min后将小鼠颈部脱臼处死，剪下左右两耳，用直径为6mm的打孔器在左右两耳相同部位打下圆耳片并称重。结果见表3。

可见，马钱子优化总生物碱的有效剂量为6 mg/kg，马钱子优化总生物碱抑制耳肿胀的效果显著优于马钱子总生物碱。

表3 马钱子优化总生物碱小鼠耳肿胀实验结果（±s，n=10）

表3 马钱子优化总生物碱小鼠耳肿胀实验结果（±s，n=10）

注：与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001；“-”表示无数据

组别 剂量 耳肿胀度（mg）抑肿率（%）空白组阳性组马钱子碱组马钱子总生物碱组优化马钱子总生物碱低剂量组优化马钱子总生物碱中剂量组优化马钱子总生物碱高剂量组-240μL 12 mg/kg 12 mg/kg 3 mg/kg 6 mg/kg 12 mg/kg 12.80±2.31?8.20±2.38△△△12.12±2.75 12.01±0.85 10.93±1.92 10.20±3.14△9.37±1.80△△35.93 7.58 6.17 14.60 20.33 26.82

3 讨论

本实验中显色液的pH值及吸收波长，对于用酸性染料比色法来测定总生物碱纯度时对测定结果有很大影响，此结论在前期已通过实验考察[6]，并确定最佳的pH值为7.2，测定波长为416 nm。总生物碱纯度的测定结果表明马钱子优化总生物碱的纯度很高，接近100%。

士的宁已经被证明抗炎镇痛效果较弱且毒性较强，例如有文献证明非士的宁马钱子总生物碱才是抗关节炎的主要有效部位[10]，因此将士的宁去除有利于减毒增效，但是要完全去除需要应用大孔吸附树脂上柱洗脱，周期长，效率低。前期研究表明马钱子碱和士的宁在50%乙醇中的溶解度分别为（455.40±0.03）和（1.60±0.03）mg/mL，溶解度相差近284倍，因此应用溶剂溶解分离就去除了绝大部分士的宁得到马钱子优化总生物碱，工艺简单，有利于推广应用。

药效学研究表明，与马钱子总生物碱相比，马钱子优化总生物碱经皮给药后对耳肿胀的抑制作用显著增强；而急性毒性试验结果也表明，静脉注射途径下，马钱子优化总生物碱的安全性提高了近5倍。这些试验结果均表明，马钱子优化总生物碱可以实现减毒增效，本研究结果与其一致。

[1]蔡宝昌，吴皓，杨秀伟，等.马钱子中16个生物碱类化合物13CNMR谱的数据分析[J].药学学报，1994，29（1）：44-48.

[2]张婷，陈军，王玮，等.马钱子碱脂质体在大鼠体内的药物动力学研究[J].中华中医药学刊，2012，28（1）：69.

[3]邹龙，桂卉，黄世超，等.不同粒径马钱子粉体中士的宁在大鼠体内的药物动力学研究[J].中华中医药杂志，2009，24（12）：1568.

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[5]于智敏，王克林，李海玉，等.常用有毒中药的毒性分析与配伍宜忌[M].北京：科学技术文献出版社，2005：59.

[6]Chen J，Wang X，Qu YG，et al.Analgesic and anti-inflammatory activity and pharmacokinetics of alkaloids from seeds of Strychnos nux-vomica after transdermal administration：Effect of changes in alkaloid composition[J].Journal of Ethnopharmacology，2012，139（1）：181-188.

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[8]王绚，陈军，蔡宝昌.马钱子体内外分析研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（13）：258-262.

[9]胡巍，陈军，蔡宝昌，等.马钱子碱经皮给药的镇痛作用[J].中华中医药学刊，2008，26（2）：385-386.

[10]魏世超，徐丽君，张秀桥，等.马钱子总生物碱对实验性关节炎的影响[J].医药导报，2002，21（6）：335-336.