UC-MSC移植对CIA大鼠炎症因子表达水平的调控作用

李 慧 顾 健 林传明 顾 薇 沈连军

1.江苏省苏北人民医院风湿免疫科，江苏扬州 225001；2.江苏省苏北人民医院血液科 扬州市血液学研究所，江苏扬州 225001

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以累及周围性小关节为主的系统性、炎症性自身免疫疾病，以关节滑膜细胞增生、炎症细胞浸润及血管翳形成为主要病理特征[1]。脐带间充质干细胞 （umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）是来源于脐带华通氏胶的一类多能干细胞，具有独特的免疫调节功能，以抑制炎性反应为主要特征。本文以胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠为研究对象，观察UC-MSC对CIA大鼠炎症细胞因子的调节作用，为临床应用UC-MSC治疗RA提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

5 周龄，雌性，清洁级 SD 大鼠，90 只，平均体重（175±10）g，购置于南京大学模式动物研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 CIA大鼠模型建立 ①分组:90只SD大鼠随机分为三组:空白对照组、模型组、UC-MSC治疗组，每组各30只；②造模:扬州大学医学院实验动物中心清洁级环境中适应性饲养1周，模型组及UC-MSC治疗组在乙醚麻醉下于第1天以每只0.1 mL（含鸡Ⅱ型胶原0.25 mg及0.05 mL完全弗氏佐剂）于SD大鼠右后足跖皮内注射，至第21天同前剂量于大鼠尾根部、左后足跖皮内再次多点激发免疫。空白对照组以生理盐水注射，方法同造模组。

1.2.2 UC-MSC移植 取融合度 85%的 P3代 UC-MSC，用0.25%胰蛋白酶消化，生理盐水清洗3遍，制成浓度为2×106/mL细胞悬液，用1 mL无菌注射器抽吸分装成0.5 mL/支（含1×106个细胞）。于造模完成后1周经大鼠尾静脉注射制备好的UC-MSC悬液0.5 mL/只；空白对照组及模型组同法注射等量生理盐水。

1.3 观察指标

1.3.1 从免疫当日起，采用双人双盲的方式在初免后1、2、3周，及治疗后1～5周，每周观察并采用关节炎指数（AI）评分法评定大鼠关节症状的严重程度。

1.3.2 于UC-MSC移植治疗后第1、3、5周，分别取空白对照组及模型组、UC-MSC组大鼠，麻醉大鼠后，经腹腔静脉取血4 mL置分离胶干燥管中，以3000 r/min、离心10 min后提取血清，置-20℃冰箱保存待测。用ELISA法检测血清白介素-1（IL-1）、IL-10、IL-17、IL-18。

1.4 AI评分法标准

据关节红肿范围和变形情况对大鼠进行评估。每只大鼠四肢评分相加，总分最高为16分。评价标准:0分=无关节炎；1分=有红色斑点或轻度肿胀；2分=关节部位中度肿胀；3分=严重肿胀，甚至皮肤破溃；4分=严重肿胀且不能负重。

1.5 统计学方法

采用Excel 2003软件及统计软件SPSS 16.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIA大鼠一般情况及关节症状

所有CIA大鼠饮食及活动减少，神疲乏力，体重增长减慢；于初次免疫后第2天注射处足踝、趾、膝关节即出现瘀斑、轻度红肿；第6天开始红肿加重，关节处皮肤充血发亮，甚至破溃，关节活动受限伴负重困难、活动障碍，红肿逐步向对侧后肢及双前肢蔓延。空白对照组无上述表现，见图1。

图1 造模前后大鼠关节表现

2.2 各组不同时期AI评分结果比较

模型组及UC-MSC治疗组CIA大鼠AI评分于初次免疫后第1周开始升高，至加强免疫后1周达最高，此后虽有下降，但仍维持在高水平状态，与同时期空白对照组比较，差异均有统计学意义 （均P<0.05）；UC-MSC治疗组大鼠经UC-MSC治疗后AI评分逐渐降低，与同时期模型组比较，差异均有统计学意义（均P<0.05）。见表1。

2.3 各组不同时期血清 IL-1、IL-10、IL-17、IL-18 浓度比较

模型组 CIA 大鼠于治疗后第 1、3、5 周 IL-1、IL-17、IL-18平均水平明显高于同期空白对照组，差异均有统计学意义（均P<0.05），而IL-10水平明显低于同期空白对照组，差异有统计学意义 （P<0.05）；UC-MSC治疗组治疗后第1、3周时IL-1、IL-17、IL-18水平较同期模型组显著降低、IL-10水平逐步上升，差异均有统计学意义（均P<0.05），至第5周上述指标与空白对照组相近，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 不同组期大鼠关节炎指数AI评分（±s，分）

表1 不同组期大鼠关节炎指数AI评分（±s，分）

注:与同时期空白对照组比较，*P＜0.05；与同时期模型组比较，ΔP＜0.05

组别 只数 造模前 初次免疫1周初次免疫2周初次免疫3周加强免疫1周治疗1周治疗2周治疗3周治疗4周治疗5周空白对照组模型组UC-MSC治疗组3030300000004.56±0.12*4.47±0.31*6.79±0.54*6.11±0.44*8.23±0.33*8.13±0.42*0000009.65±0.28*9.60±0.19*8.15±0.19*7.34±0.41*Δ 7.98±0.41*6.29±0.16*Δ 7.35±0.63*5.68±0.22*Δ 7.31±0.27*4.67±0.55*Δ 7.52±0.18*3.01±0.72Δ

表2 各组不同时期血清IL-1、IL-17浓度结果比较（±s，pg/mL）

表2 各组不同时期血清IL-1、IL-17浓度结果比较（±s，pg/mL）

注:与同时期空白对照组比较，*P ＜ 0.05；与同时期模型组比较，ΔP ＜ 0.05

组别 只数 IL-1（pg/mL）治疗1周 治疗3周 治疗5周IL-17（pg/mL）治疗1周 治疗3周 治疗5周空白对照组模型组UC-MSC治疗组30303033.08±8.1165.33±12.21*5.38±6.48*Δ 36.63±9.6657.70±5.09*42.16±8.24Δ 71.98±1.9866.20±0.79*74.42±2.58*Δ 73.77±1.8670.72±0.19*73.24±8.96Δ 75.60±6.5269.97±0.29*77.92±0.01Δ 34.24±4.3450.55±9.61*33.01±6.54Δ组别 只数 IL-10（ng/L）治疗1周 治疗3周 治疗5周IL-18（ng/L）治疗1周 治疗3周 治疗5周空白对照组模型组UC-MSC治疗组303030168.72±29.56277.12±20.82*222.86±24.50*Δ 212.23±32.77317.16±38.85*234.46±28.41Δ 255.52±21.71325.50±28.39*250.56±27.22Δ 221.32±3.94250.03±10.48*232.72±3.85*Δ 210.79±2.97225.76±3.91*226.13±4.95*222.39±9.71222.82±1.83217.41±1.06*Δ?

3 讨论

RA是一种慢性系统性自身免疫疾病，在其发生、发展过程中存在多种细胞因子分泌的异常。CIA大鼠是RA最常用、最经典的动物模型，其特征除病变关节炎性细胞浸润、滑膜增生、关节软骨及骨组织破坏外，还兼有体液免疫及细胞免疫功能紊乱的特点，其发病机制与人类RA有很多相似之处[2]。本文采用P3代UC-MSC治疗CIA大鼠，以探讨其对CIA大鼠炎性因子的免疫调节作用。

UC-MSC是来源于脐带华通氏胶发育早期中胚层的多能干细胞，具有自我更新、高增殖分化潜能及免疫调节等功能的多能干细胞，无MHC的限制，效应呈剂量依赖性[3]。除能抑制促炎症细胞的增殖和促炎性细胞因子的分泌之外，还能在特定的微环境中直接分化为各种组织细胞进行损伤修复[4]。

本研究观察到，造模后CIA大鼠关节明显红肿、活动功能受限，AI评分亦逐渐增高，其血清IL-1、IL-17、IL-18水平明显高于正常空白对照组，而IL-10水平则显著降低，差异均有统计学意义（均P<0.05）。既往研究表明，IL-1是主要由单核细胞、巨噬细胞分泌的最具有多效性的细胞因子之一，可调节多种炎性细胞、免疫调节分子及前炎症介质的表达，能导致细胞外基质的破坏与重建，加快RA的关节破坏进程，在RA的骨侵蚀及软骨破坏中发挥重要作用[5]。IL-17主要由辅助性Th17细胞产生，可刺激成纤维细胞、上皮及内皮细胞释放多种促炎症细胞因子，并可诱导成纤维细胞表达细胞间黏附分子（ICAM-1）、促进T细胞增殖，以及与多种细胞因子协同放大炎症反应，加剧RA关节的破坏[6]。IL-18是天然性和适应性免疫应答的重要调节因子。研究亦表明RA患者的血清和滑液中的IL-18均明显升高，并且滑液中IL-18水平与RA活动呈相关性[7-8]，此外，IL-18可诱导软骨细胞生成基质金属蛋白酶MMP-1等而促进软骨的降解[9]。IL-10是一种重要的炎症抑制因子，主要是由活化的Th2细胞、单核细胞及B细胞产生，可抑制有核细胞分泌多种细胞因子IL-1、肿瘤坏死因子-α等以发挥抗炎作用，亦可抑制单核细胞表面分子的表达，降低单核细胞的提呈抗原能力，阻断抗原特异性单核-巨噬细胞因子的产生。有研究认为，IL-10水平的降低可能会导致RA炎症的发展和组织破坏的加重[10]。本研究中，经UC-MSC治疗后IL-1、IL-17、IL-18水平逐渐降低、IL-10水平回升（P<0.05），至实验观察后期所有指标水平均接近空白对照组（P>0.05），实验结果表明CIA大鼠体内存在免疫系统紊乱，导致促炎性细胞因子IL-1、IL-17、IL-18分泌异常增高，而炎症抑制因子IL-10水平降低，机体处于促炎功能亢进、炎症抑制功能缺陷的状态，从而导致了疾病的发生与发展。UC-MSC可显著降低CIA大鼠血清炎症因子IL-1、IL-17、IL-18水平，而上调IL-10水平，通过其免疫调节功能恢复机体免疫系统平衡状态，减少炎性物质的渗出，减轻炎症反应，促进病变关节恢复。另外，有研究表明UC-MSC可靶向归巢至炎症病变部位，促进病变恢复。

总之，RA发病机制复杂，目前研究认为与机体免疫功能紊乱有关，其机体免疫功能处于紊乱状态，使促炎症细胞激活及功能亢进，而炎症抑制细胞下调及功能缺陷，从而引起细胞因子的释放及其他免疫细胞的活化、免疫球蛋白、趋化因子、氧自由基及白三烯等炎症介质产生增多，进而引起关节血管炎、滑膜增生、软骨及骨破坏。本研究中采用的UCMSC具有独特的生物学特性，既可在多环节上调节免疫，诱导免疫重建，恢复机体免疫系统平衡状态；又可通过炎性趋化作用直接参与损伤的修复，并能分泌多种基质分子，改善局部受损微环境加速损伤修复，促进病变恢复，为临床运用UC-MSC治疗RA提供实验依据。

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