制片式细胞培养板的制作及其实用性研究

潘慧娟，尹洪萍，陈功星

（杭州师范大学医学实验中心，浙江杭州 310036）

制片式细胞培养板的制作及其实用性研究

潘慧娟，尹洪萍，陈功星

（杭州师范大学医学实验中心，浙江杭州 310036）

为了研发一种集成细胞培养和制片功能的生物技术产品，通过在24孔细胞培养板上进行设计制作，再进行SW480细胞培养，最后经瑞氏－吉姆萨染色分析，结果表明，该技术产品能够把细胞培养与细胞制片完美的结合起来，具有一定的创新和实用价值.

细胞培养；制片；创新；实用

细胞培养研究的发展，很大程度上是建立在新方法、新发明的基础之上.细胞培养研究中的任何技术上的进步，都能极大地促进细胞研究工作的开展.细胞制片是细胞培养研究中一个重要的技术内容，它是细胞形态分析以及免疫组织化学技术中一个必不可少的操作过程，即把细胞附着于透明的支撑物上.现有商品化的内置玻璃片无菌培养皿用于培养细胞制片，取得了一定程度的成果，被广大生物医学基础研究、教学人员认同.作者曾对该产品在细胞培养制片方面做了一定的改善［1］，但还存在一些不足，尚有一定的发展空间.作者在前期研究工作的基础上，采用了更加安全、实用的方法，研制出了集细胞培养和制片功能于一体的制片式细胞培养板（该产品已获专利，专利号：201020257177.7），并对其实用性进行了研究.

1 材料与方法

1.1 材料

小牛血清、RMPI－1640和24孔细胞培养板均购于GIBCO公司.篆刻刀、三角板、圆规、铅笔均购于杭州文教用品店.配制瑞氏染色液（瑞氏染料1g＋甲醇600mL）、（pH 6.4～6.8）磷酸盐缓冲液PBS（1000 mL中含磷酸二氢钾0.3g＋磷酸氢二钠0.2g）、姬姆萨染色液（姬姆萨燃料1g＋甘油66mL＋甲醇66 mL）.

1.2 方法

1.2.1 制片式细胞培养板的制作

取废弃的24孔培养板，圆规、三角板测量孔内径（R），根据公式计算不同等边多边形的每条边长度（L）：L＝R＊con［（180°（－360°（/n）/2］（n为多边形的边数），计算多边形的边长，再取无菌同样的24孔细胞培养板，去除无菌包装，保持封盖状态.用三角板和铅笔在孔底背面按照边长（L）绘出相应的多变形，然后用篆刻刀雕刻，形成沟槽，以便于方便取出每个孔底板.并在每个孔底板背面的一侧用篆刻刀写出标记.

1.2.2 细胞制片

经制备过的制片式细胞培养板，紫外光下照射0.5h，然后按照细胞培养操作，取人大肠癌细胞SW480，1×106接种于细胞培养板孔中，常规培养于含10%小牛血清（经56℃水浴30min灭活）的RMPI－1640培养液中（含100U/mL的青、链霉素），在37℃、5%CO2浓度及饱和湿度条件下进行培养.24h后，取出培养板尽量弃去培养液，1200rpm离心5min后，立即用吸管吸弃24孔板中分布在边缘的残余液体，加入数滴甲醇固定［1］，3min后翻转细胞培养板，手指用力按下细胞制片，翻转细胞制片，让其自然干燥后拍照.按照文献［2］对细胞面进行瑞氏－吉姆萨染色，最后置玻璃片上于显微镜下观察并拍照.

2 结 果

从等边的三边形到六边形，制备了4种制片式细胞培养孔（见图1），每孔底背刻有英文大写字母和阿拉伯数字组成的标识，便于区分每个细胞孔.将其中一个细胞孔底板（标识C1）按下后，翻转后反写的标识成为正写（图2A）.SW480细胞染色后镜下可见图片饱满，层次分明，细胞大小均匀，分布自然，界限分明，形态完整，没有皱缩现象.细胞梭形为主，与培养液中细胞大小形状相同.胞质浅兰紫色，胞核呈现玫瑰红，位于细胞中央，占大部分面积，少部分细胞核可见明显浓缩的核块（图2B）.

3 讨 论

细胞生物学的发展，在很大程度上得益于研究技术的进步，17世纪显微镜的发明开创了这门现代生命科学的前沿分支学科［3］，与显微镜相关的细胞培养技术更是起到了推波助澜的作用［4］.虽然这些技术已经发展到非常高的程度，但仍然存在发展的空间，尤其是小的技术方面，有利于不同条件下开展和对高技术的补充.本文介绍的技术就属于这类，是伴随作者对研究工作的深入，在已经研究的细胞制片成果上，能够把细胞培养与细胞制片完美的结合起来，不久的将来，能够使用该商品化的制片式细胞培养板，培养细胞制片操作将上升到一个新的台阶.细胞培养孔底板沟槽结构有利于底板的分离，大写的英文字母分别依次代表行号，阿拉伯数字依次代表列号，它们的组合赋予了细胞培养板各个孔独特的标识（图1），标识反写于底板背面，从上往下观察时成为正读（图2A），这样有利于识别细胞制片的正反面，在染色及其他细胞操作过程中确定细胞面.本文制备使用的六边形细胞制片，在大部分细胞操作过程中是最方便的，而且六边形是自然界中最合理的一种几何结构.细胞制片经过瑞氏－吉姆萨染色以后（图2B），效果与前期报道相一致［2］.该研究在制片方式上的改进，不同于前期报道的贴壁细胞培养后进行制片，操作过程中没有加热塑料产生有害气体［1］，是对前期工作的提升和发展，是新近开发的一款细胞培养制片技术产品，且该产品也适用于悬浮细胞培养制片.

［1］方黎祥，刘芳芳，张婷婷，等.一种贴壁培养细胞制片方法［J］.生物学通报，2010，3（9）：50.

［2］陈功星.贴壁培养细胞简便染色方法［J］.生物学通报，2007，42（12）：45.

［3］Botstein D.Technological innovation leads to fundamental understanding in cell biology［J］.Mol Biol Cell，2010，21（22）：3791－3792.

［4］Park T H，Shuler M L.Integration of cell culture and microfabrication technology［J］.Biotechnol Prog，2003，19（2）：243－253.

The Manufacture and Practicality of Cell Culture－Slide Plate

PAN Hui－juan，YIN Hong－ping，CHEN Gong－xing

（Medical Laboratory Center，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China）

To develop a biotechnological product with integrated functions of cell culture and microscopy slide，the experiment designed and produced on a cell culture plate with 24holes，cultivated the SW480cell，stained and analyzed with Wright－Giemsa.The results show that the technological product can perfectly integrate the cell culture with microscopy slide，which has innovative and practical value.

cell culture；microscopy slide；innovative；practical

Q－33

A

1674－232X（2012）05－0407－03

11.3969/j.issn.1674－232X.2012.05.005

2012－04－06

杭州市属高校重点实验室科技创新项目（20090233T13）；浙江省医药卫生科学研究基金项目（2009B125）.

陈功星（1966—），男，副教授，博士，主要从事细胞分子生物学研究.E－mail：chengx＠yahoo.com.cn