Th1细胞在NOD小鼠糖尿病早期的应用

王弘珺 李质馨 杨 柳 田洪艳 徐 冶 朱辛为 刘忠平

(吉林医药学院组织胚胎学教研室，吉林 吉林 132013)

60%～80%的雌性NOD小鼠出生后12 w会自发出现糖尿病症状，属于1型糖尿病，是由T细胞介导的自身免疫性疾病。研究表明，Th1细胞分化发育异常在1型糖尿病的发生中起重要作用〔1〕。本文选择4 w、8 w和16 w雌性NOD小鼠，测定不同年龄NOD小鼠血糖的变化及脾和胰腺内Th1细胞的变化，探讨Th1细胞在NOD小鼠糖尿病早期中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 4 w、8 w和16 w清洁级(SPF)NOD雌性小鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，每组6只。荧光标记的抗小鼠CD4、CD25和干扰素-γ(IFN-γ)单抗及同型对照抗体BD，抗小鼠免疫球蛋白受体(FcR)单抗(自制)，抗T-bet抗体(武汉博士德)，链霉素生物蛋白过氧化物酶法(S-P)试剂盒(福州迈新生物)，离子霉素(Ionomycin，lon)和佛波醇酯(PMA)(Sigma)。Golgi Stop BD，流式细胞仪和血糖仪(美国强生)。

1.2 方法

1.2.1 血糖检测 无菌取小鼠尾静脉血用血糖仪检测血糖。

1.2.2 脾细胞的制备 乙醚麻醉，取小鼠脾，用毛玻璃片挤压，过200目尼龙网制成单细胞悬液，用红细胞裂解液去除红细胞，悬浮于PBS中，计数。

1.2.3 脾Th1细胞的测定 取2×106细胞用PMA和Ionomycin活化4～6 h，同时加入Golgi Stop，CD4+T细胞内IFN-γ的染色过程按照BD说明书进行，上机检测。

1.2.4 胰腺免疫组化 取胰腺，10%中性甲醛缓冲液4℃固定24 h，然后各级酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋。常规石蜡切片，梯度酒精脱水，抗原修复;双蒸水洗入3%H2O210 min，PBS洗涤;山羊血清室温封闭10 min;加1∶100稀释抗T-bet抗体，4℃过夜，PBS洗涤;生物素标记的山羊抗小鼠IgG抗体室温10 min，PBS洗涤;SD室温10 min，PBS洗涤;DAB显色2 min，脱水透明封片。阴性对照用PBS代替一抗。

1.3 统计学方法 应用SPSS11.5统计软件进行分析，结果用s表示，数据分析采用t检验。

2 结果

2.1 血糖的变化 实验所用雌性NOD小鼠，4 w时血糖为(5.08±0.22)mmol/L，8 w 时血糖为(6.48±0.53)mmol/L，16 w时血糖为(11.59±0.92)mmol/L，血糖呈进行性增高，16 w与8、4 w之间差异显著(P＜0.01，P＜0.001)。

2.2 CD脾Th1细胞的变化 Th1细胞属于CD4+T细胞亚群，主要分泌细胞因子IFN-γ，CD4+IFN-γ+T细胞即为 Th1细胞。4、8、16 w NOD小鼠脾Th1细胞的百分数分别为(2.46±0.10)%、(2.84±0.30)%及(5.07±0.91)%，16 w NOD小鼠脾Th1细胞的百分数高于4 w和8 w NOD小鼠(P＜0.05;P＜0.01)。

2.3 胰腺内Th1细胞的变化 4 w NOD小鼠胰腺内未见Th1细胞浸润，从8 w开始NOD小鼠胰腺内Th1细胞浸润逐渐增加。见图1。

图1 胰腺Th1细胞免疫组化(×200)

3 讨论

NOD小鼠出生4 w开始胰岛周围逐渐出现淋巴细胞浸润，12 w时60%～80%雌性小鼠出现糖尿病症状，并进行性加重，其糖尿病病理变化和临床表现均类似人类1型糖尿病，是目前研究1型糖尿病的主要动物模型。细胞免疫异常是引起NOD小鼠发生糖尿病的原因之一，尤其是CD4+T细胞亚群分化失衡在糖尿病进程中起重要作用〔1，2〕。CD4+T细胞亚群主要有Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和CD4+CD25+Treg细胞，其中Th1释放 IFN-γ、肿瘤坏死因子 α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)引起炎症反应，与糖尿病时胰岛β细胞凋亡有关〔3〕，直接参与了糖尿病的发生过程。目前，对于NOD小鼠糖尿病初期外周和胰腺内Th1细胞的变化并不完全清楚。本文研究了4 w、8 w和16 w雌性NOD小鼠血糖的变化及脾和胰腺内Th1细胞的变化。本研究中，随年龄增加雌性NOD小鼠血糖逐渐升高，至16 w时已经出现高血糖，并出现其他糖尿病症状如尿糖阳性等。为了研究Th1细胞的变化，通过流式细胞仪检测了脾Th1细胞，通过免疫组化检测了胰腺内Th1细胞。流式细胞仪结果显示4 w、8 w和16 w NOD小鼠脾Th1细胞逐渐升高，16 w时NOD小鼠脾Th1细胞显著高于4 w时。说明，NOD小鼠糖尿病早期外周Th1细胞亚群异常增加，其原因可能与CD4+CD25+Treg细胞不足有关。有研究表明，1型糖尿病中CD4+CD25+Treg细胞有缺陷，不能维持自身免疫耐受〔4～8〕，这可能引起Th1细胞增加，导致NOD小鼠发生糖尿病。

T-bet是诱导Th1细胞分化的关键转录因子，4 w NOD小鼠胰腺内并未检测到T-bet阳性细胞，说明这时Th1细胞没有明显浸润到胰腺。在8 w和16 w NOD小鼠胰腺内检测到大量的T-bet阳性细胞，说明Th1细胞大量浸润胰腺，参与胰腺β细胞凋亡，于是出现高血糖等糖尿病症状。

1型糖尿病患者主要为青少年，糖尿病表现是由于胰岛β细胞破坏所引起。免疫因素在1型糖尿病发生中起重要作用，尤其是Th1细胞及其释放的细胞因子在糖尿病发生早期起关键作用。在1型糖尿病发生早期，通过中西药治疗降低Th1细胞，减轻胰岛β细胞凋亡，能够延缓糖尿病症状的出现。

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