益气养血化瘀汤对实验性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡及Bax、Bcl－2蛋白表达的影响

姜元辉，段富津，潘志

(1．黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2．黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

益气养血化瘀汤是导师段富津教授在多年临床实践中总结出来的治疗冠心病一系列有效方剂之一，该方对气血两虚兼血瘀型冠心病有确切的疗效。本研究将观察益气养血化瘀汤对心肌细胞凋亡与相关蛋白表达干预的作用。阐明益气养血化瘀汤治疗心肌缺血的作用机理，为其推广应用提供坚实的理论基础。

1 材料与方法

1．1 动物与药物

健康Wistar大鼠60只，体质量(250±10)g，雌雄各半，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。合格证号为(吉)第2007－0003号。按体质量将60只健康实验用大鼠随机分为空白对照组(以下简称空白组)、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、地奥心血康阳性对照组(以下简称对照组)6组。每组10只，饲养1周。

益气养血化瘀汤(由黑龙江中医药大学制剂室提供);地奥心血康胶囊(批号0810044，100mg/粒，成都地奥制药公司，用时将胶囊去壳，内容物用蒸馏水配制成混悬液);盐酸异丙肾上腺素(ISO)注射液(批号080402，1mg/2ml，上海禾丰制药有限公司);乌拉坦(沪Q/HG22－771/68，批号 010205);Bcl－2免疫组化染色试剂盒(产品代号:SA2015)，细胞凋亡检测试剂盒(产品代号:MK1020)，Bax免疫组化染色试剂盒(产品代号:SA1022)，以上试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1．2 实验器材

普通光学显微镜(日本，OLYMPUS);摄影显微镜(CH)型(日本，OLYMPUS);LKB－V超薄切片机(瑞典)。

1．3 实验方法

按人与大鼠体表面积换算灌胃给药，高、中、低剂量组比例为4∶2∶1，剂量分别为高剂量组 (28．58g/kg)，中剂量组(14．29g/kg)，低剂量组(7．145g/kg)，对照组(41．49mg/kg)。大鼠每次灌胃 1．5ml/100g。模型组每天相应给以生理盐水。与造模后开始给药，每日2次，连续给药7天。

按文献方法进行心肌组织切片制备［1］，心肌细胞凋亡原位标记检测及计算机图像分析［2］，免疫组化法检测 Bcl－2 与 Bax［3］。

1．4 统计学处理 采用SPSS 12．0统计软件对上述检查结果进行分析处理。实验数据以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0．05为差异具有显著性差异，P＜0．01为差异具有极显著性差异。

2 结果

2．1 心肌细胞凋亡变化

通过TUNEL法检测了心肌细胞凋亡情况及治疗组的干预作用，实验结果显示，光镜下正常组大鼠未见明显阳性反应。其他各组凋亡心肌细胞TUNEL阳性标记表现为心肌凋亡阳性细胞的细胞核为深浅不一的棕褐色，细胞轮廓清楚;而正常细胞核呈蓝色，心肌细胞轮廓完整。各治疗组细胞凋亡指数与模型组相比，均有极显著差异(P＜0.01)见表1。

表1 益气养血化瘀汤治疗前后各组实验大鼠细胞凋亡指数的比较(±s，n=10)

表1 益气养血化瘀汤治疗前后各组实验大鼠细胞凋亡指数的比较(±s，n=10)

注:与空白组比较，▲P ＜0．01;与模型组比较，★P＜0．05，★★P ＜0.01。

AI空白组组别n 10 0．79 ±0．12模型组 10 2．44 ±0．18▲低剂量组 10 2．21 ±0．20★★中剂量组 10 1．73 ±0．16★★高剂量组 10 1．40 ±0．16★★对照组 10 1．50 ±0．18★★

表2 益气养血化瘀汤治疗前后各组实验大鼠Bax和Bcl－2蛋白表达灰度值比较(±s，n=10)

表2 益气养血化瘀汤治疗前后各组实验大鼠Bax和Bcl－2蛋白表达灰度值比较(±s，n=10)

注:与空白组比较，▲P ＜0．01;与模型组比较，★P＜0．05，★★P ＜0.01。

BaxBcl－2空白组组别n 10 153．4 ±5．32 190．1 ±8．95模型组 10 172．4±5．48▲ 161．3±6．18▲低剂量组 10 164．3±5．23★★ 168．3±6．34★中剂量组 10 158．7±6．57★★ 169．1±5．88★高剂量组 10 155．3±4．72★★ 182．8±10．26★★对照组 10 155．6±6．57★★ 174．2±6．66★★

2．2 急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡相关基因Bcl－2、Bax表达水平

由表2可知，治疗各组在Bax蛋白表达上与模型组相比，均有极显著差异(P＜0.01);在Bcl－2蛋白表达上，益气养血化瘀汤中、低剂量组与模型组相比，差异显著(P＜0.05)，而高剂量组与模型组比较，差异极显著(P＜0.01)。

3 讨论

胸痹一病总以气虚为本，血瘀为标，益气养心活血汤具气血双补之功。使阳生阴长，气血速生，同时补中寓行，行中有补，使补而不滞，药力迅速布达周身，全方共奏益气养血活血之功，使心有所主，神有所安，诸症自除。

Bcl－2蛋白是一种膜整合蛋白，存在于细胞中的线粒体核膜、内质网膜上，并对抗各种凋亡的刺激而对细胞起保护作用，且主要作用在线粒体。Bcl－2蛋白家族的成员有促进和抑制凋亡的功能。Bcl－2通过与Bax结合抑制凋亡并促进细胞存活，Bcl－xs通过与Bcl－2的结合置换Bax，启动凋亡。这一模式很可能是Bcl－2家族蛋白作用于凋亡过程的基本模式。在缺血缺氧状态下，心肌细胞可发生凋亡。心肌细胞凋亡是缺血心肌损伤的重要机制，可导致心肌重构，引发心律失常或心力衰竭［4］。实验结果显示，心肌缺血模型组大鼠心肌不仅细胞凋亡发生率极高，且心肌细胞Bax蛋白表达也明显上调，同时发现，心肌缺血模型组大鼠心肌细胞Bcl－2蛋白表达有所减弱。益气养血化瘀汤能明显下调凋亡刺激基因Bax的蛋白表达，上调凋亡抑制基因Bcl－2的蛋白表达，通过调节缺血心肌Bax、Bcl－2基因的蛋白表达从而抑制和阻断细胞凋亡的发生，这也是益气养心活血汤防治CHD(冠心病)心肌缺血损伤的分子病理机制之一。

［1］ 王大安，蔺志华．血府逐瘀汤干预急性心肌缺血心肌细胞凋亡与Bcl－2、Bax表达的实验研究［J］．中西医结合心脑血管病杂志，2009，7(1):44－45．

［2］ 王大安，李建文．丹参饮干预急性心肌缺血心肌细胞凋亡与Bcl－2、Bax表达的实验研究［J］．中华中医药学刊，2009，27(7):1513－1514．

［3］ 潘志．冠心康抗大鼠急性心肌缺血及对p53和Bcl－2的干预研究［D］．哈尔滨:黑龙江中医药大学，2005．

［4］ 王学颖，王阶，杨戈．心梗后的心肌细胞凋亡与中医药干预研究进展［J］．中医药学报，2010，38(2):57－59．