手术创伤引起的海马炎症反应对老年小鼠术后认知功能的影响*

何 龙，艾艳秋，储勤军，鲁稳梁，张 卫

郑州大学第一附属医院麻醉科 郑州450052

#通讯作者，女，1963年9月生，博士，教授，研究方向:麻醉学，E-mail:aiyanqiu82@sohu.com

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是老年人术后常见的中枢神经系统并发症，主要表现为术后记忆力、判断力及认知功能受损，同时伴有社会活动能力减退［1］。POCD 的确切发病机制目前尚不明确。作者观察了老年小鼠肝脏部分切除术后认知功能和海马炎症因子表达水平的变化，以探讨围术期手术创伤引起的神经炎症反应对术后认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组 96 只健康雄性昆明小鼠由河南省实验动物中心提供，月龄16 个月，体质量30～40 g。采用随机数字表法分为4组，每组24只。对照组(NS组)腹腔注射生理盐水0.1 mL/10 g;麻醉组(Ane组)腹腔内注射芬太尼0.2 mg/kg、氟哌利多5 mg/kg 行动物麻醉;假手术组(Sham组)和手术组(Sur组)采用与Ane组相同的麻醉方法行动物麻醉，待反正反射消失后，腹部拟切口部位常规备皮消毒，于剑突下腹部正中做一2.0 cm 左右切口。Sham组打开腹腔，5 min 后，腹腔注射生理盐水0.3 mL 补充液体丢失，2.5 g/L 的丁哌卡因浸润切口，以0 号丝线分层缝合腹膜和腹壁; Sur组打开腹腔后充分暴露肝脏，棉签抬起肝脏左外侧叶，充分游离后结扎，剪下肝脏左外侧叶(约占整个肝脏体积的1/3)，后续处理同Sham组。手术时间约20 min。待动物清醒后放回铺有棉纱布垫的笼具，注意保暖。

1.2 认知功能测试 采用Morris 水迷宫法［2］，包括定位航行实验和空间探索实验两个部分。术前进行定位航行实验，历时5 d，动物面向池壁随机从4 个入水点放入水迷宫中，共4 次。寻找平台(平台置于Ⅰ象限，直径10 cm，没于水面下1 cm)最大时限设定为60 s，取当天4 次测试结果平均值进入最后统计分析。麻醉或手术后第1、3、7 天，分别从各组中随机抽取8 只动物进行空间探索实验［即撤去平台，选取平台正对象限(Ⅲ象限)的中点为入水点将动物面向池壁放入水中，自由游泳60 s］。摄像系统及相应分析软件自动分析记录动物游泳轨迹、逃避潜伏期、游泳距离、游泳速度、目标象限停留时间百分比、1 min 内穿越平台次数等参数。

1.3 海马组织IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白及mRNA的表达检测 认知功能测定完毕后，动物麻醉下处死取脑，迅速分离海马，置入液氮中，后转存至－80℃低温冰箱保存，以检测IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白及其mRNA 的表达水平。

1.3.1 Western blot 法检测海马IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的表达 海马组织加入RIPA 裂解液，低温匀浆，4℃下12 000 g 离心5 min，取上清液。BCA 法测定样品蛋白浓度。取蛋白样品40 μg 与等体积的上样缓冲液混合，煮沸10 min，100 g/L SDS 凝胶电泳后，转至PVDF 膜，50 g/L 脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗按(按1∶ 1 000 稀释，英国Abcam 公司)和βactin(按1∶ 1 000 稀释，英国Abcam 公司)，4℃孵育过夜，TBST 洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(按1 ∶ 4 000 稀释)及鼠抗β-actin 抗体(按1∶ 5 000 稀释)，37℃孵育2 h，TBST 洗膜，ECL化学发光液X 光片曝光显色。采用UVP 凝胶成像系统分析仪采集图像，Quantity One 软件进行分析，以目的蛋白与β-actin 灰度值的比值代表IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达水平。

1.3.2 Real Time RT-PCR 法检测海马IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表达 Trizol 总RNA 提取试剂盒(TaKaRa 公司)抽提总RNA，参照逆转录试剂盒(TaKaRa 公司)进行逆转录反应。应用软件Premier 5.0 设计其扩增引物，由大连宝生物公司合成。β-actin 上游引物序列5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物序列5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，扩增产物大小为150 bp;IL-1β 上游引物序列5’-TCCAGGATGAGGACATGAGCAC-3’，下游引物序列5’-GAACGTCACACACCAGCAGGTTA-3’，扩增产物大小为105 bp; IL-6 上游引物序列5’-AAATTCGGTA CATCCTCGAC-3’，下游引物序列5’-CCTCTTTGCT GCTTTCACAC-3’，扩增产物大小为84 bp; TNF-α 上游引物序列5’-GTTCTATGGCCCAGACCCTCAC-3’，下游引物序列5’-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3’，扩增产物大小为175 bp。采用SYBR Green Real Time PCR 试剂盒(TaKaRa 公司)对逆转录产物进行扩增。PCR 反应条件:95℃预变性1 min;95℃变性30 s，58℃退火35 s，72℃延伸1 min，共40 个循环;最后72℃延伸10 min。以2－ΔΔCT法计算IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA 的表达水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0 处理数据，4组逃避潜伏期和潜伏期内游泳总路程的比较应用重复测量数据的方差分析，其他指标的比较应用析因设计的方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 术前定位航行实验逃避潜伏期及逃避潜伏期内游泳总路程比较 见表1。各组逃避潜伏期、潜伏期内游泳总路程随着训练时间的增加而逐渐减小，同一时间点各组间比较差异无统计学意义。

2.2 术后游泳速度、目标象限停留时间百分比及1 min 内穿台次数的比较 见表2。术后第1、3、7 天，4组动物游泳速度比较差异无统计学意义; 目标象限停留时间百分比及1 min 内穿台次数比较差异有统计学意义。

表1 4组术前逃避潜伏期、潜伏期游泳总路程的比较(n=24)

表2 术后第1、3、7 天4组动物游泳速度、目标象限停留时间百分比及1 min 内穿台次数的比较(n=8)

2.3 术后第1、3、7 天4组动物海马IL-1β、IL-6 及 TNF-α 蛋白和mRNA 表达水平的比较 见表3、4。

表3 术后第1、3、7 天4组动物海马IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白的表达水平比较(n=8)

表4 术后第1、3、7 天海马IL-1β、IL-6 及TNF-α mRNA 的表达水平比较(n=8)

3 讨论

POCD 的确切病因目前尚不明确。研究［3］表明中枢炎症反应在与衰老有关的认知功能减退中起重要作用，而手术创伤引起的炎症反应是围术期发生的重要病理生理学改变。小鼠各肝叶相对质量恒定，肝左叶切除能够获得恒定的切除率，损伤程度容易控制，仅切除小鼠肝左叶不会引起肝功能和机体物质代谢障碍［4］。且有研究［5］报道针对老年小鼠手术创伤引起的中枢炎症反应较成年小鼠更为强烈，因此该实验选用老年小鼠实施肝左叶切除手术，检测术后海马炎症因子表达水平和认知功能改变，观察手术创伤引起的海马炎症反应对老年小鼠术后认知功能的影响。

该实验中术前各组动物逃避潜伏期、潜伏期游泳总路程随着实验时间增加而逐渐减小，表明动物对空间环境逐渐形成了记忆。Sur组术后认知功能明显受损，同时伴有海马炎症因子表达上调，但Sur组认知功能下降程度和炎症因子表达水平均高于Sham组，可能是由于Sur组的创伤严重程度高于Sham组所致。有研究［6］报道创伤后炎症因子表达水平与创伤严重程度密切相关，而中枢较高浓度的炎症因子对学习记忆功能的损害可能更加严重［7］。

中枢神经系统生理浓度的IL-1β、IL-6、TNF-α在学习记忆过程中具有重要作用，但过量表达却能够导致学习记忆功能损害; 海马是脑内炎症因子受体表达的聚居区，对炎症反应引起的损伤更为敏感［8］。TNF-α 在炎症反应的起始阶段和级联放大过程中具有重要作用，参与调控细胞因子、趋化因子的释放和中枢胶质细胞的激活，可通过活化中枢免疫细胞、招募外周循环中的免疫细胞进入中枢，引起神经炎症反应，产生过量炎症因子，最终导致动物学习记忆功能障碍［9］。IL-1β 也参与神经炎症反应的调控过程，中枢脑组织IL-1β 持续过量表达能够导致认知功能损害［10］。而IL-6 作为内源性热原质，通过易化其他促炎介质的促炎作用，加重炎症反应对认知功能的损伤［11］。

综上所述，老年小鼠肝脏部分切除术能够引起术后认知功能障碍，其机制可能与手术创伤所导致的中枢海马组织中炎症因子IL-1β、IL-6 及TNF-α的表达上调有关。

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