人ABCB6表达载体的构建及稳定表达细胞株A375的筛选

张彩娥 陈 岚 任伟萍 梅爱华 邓云华＊

人ABCB6表达载体的构建及稳定表达细胞株A375的筛选

张彩娥1陈 岚2任伟萍2梅爱华2邓云华2＊

（1华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科，2皮肤科，武汉430030）

目的 构建表达载体pIRES2-Zs Green1-ABCB6，在转染的人黑素瘤细胞系株A375中筛选其稳定表达的细胞株。方法 抽取健康人外周血，分离外周血单个核细胞，提取总RNA，逆转录获取c DNA序列，加入特异性引物经PCR扩增获得ABCB6 c DNA双链，再经过B gl II、E co RI双酶切PCR产物及质粒载体pIRES2-Zs Green1，酶切产物经回收、T4 DNA连接酶连接，产物转化到大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆经菌落PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析，以确定构建质粒正确。转染人黑素瘤细胞株A375，G418筛选稳定表达ABCB6的单克隆细胞株，应用荧光显微镜鉴定ABCB6蛋白的表达情况。结果pIRES2-Zs Green1-ABCB6质粒经菌落PCR、酶切、测序鉴定正确，经过G418筛选后获得稳定细胞株，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白在A375细胞中的表达。结论 表达载体pIRES2-Zs Green1-ABCB6构建正确，并成功筛选出稳定表达ABCB6的A375细胞株，为进一步研究ABCB6的生物学功能奠定了良好基础。

ABCB6；表达载体；转染；A375细胞

腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC转运蛋白）是一大类跨膜蛋白，利用水解ATP的能量对溶质中多种内、外源性生物分子进行跨膜转运，其转运的底物包括：糖、氨基酸、金属离子、多肽、蛋白质、细胞代谢产物和药物等。ABC转运蛋白广泛存在于真核和原核生物中，在人类基因组中迄今已鉴定出49个ABC转运蛋白超家族成员，分为 A-G 七个亚族［1-2］。ABCB家族基因仅存在于脊椎动物基因组中，人类基因组有11个成员，其中ABCB1是第一个被发现的人类ABC转运蛋白。由于多个成员与肿瘤多药耐药（MDR）相关，所以ABCB亚族又被称为ABC转运蛋白MDR家族。作为其中一员，ABCB6不仅与MDR有关，还与多种肿瘤发病相关［3］，但迄今ABCB6在其中的功能与作用尚未明确。为进一步研究ABCB6的生物学功能和潜在的临床应用价值，本研究对ABCB6进行克隆并构建其表达载体pIRES2-Zs Green1-ABCB6，建立稳定表达 ABCB6基因的人恶性黑素瘤A375细胞株。

材料和方法

1.材料

本实验所用菌株为大肠杆菌DH5α，质粒为pIRES2-Zs Green1，均由华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科实验室常规保存。Trizol RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、Pf u高保真DNA聚合酶和d NTP购自大连宝生物工程有限公司。聚合酶链式反应（pol y merase chain reaction，PCR）上 游 引 物 P1：5’-GGAAGATCTATGGTGACTGTGGGCAACT-3’，在其5’端引入酶切位点B glII；下游引物P2：5’-CCGGAATTCTCACCGTTCCATGGTCTGA-3’，在其5’端引入酶切位点E co-RI，引物由上海Invitrogen生物技术有限公司合成。T4 DNA连接酶、限制性内切酶B gl II、E co RI、A flII、DNA分子量Marker购自华美生物科技有限公司。DMEM培养液、无血清OPTI-MEM培养基、0.25%胰酶和胎牛血清购自美国Gibco公司，药物G418和Lipof ecta mineTM2000试剂购于Invitr ogen公司，人黑素瘤细胞株A375由华中科技大学同济医学院免疫学系友情提供。

2.方法

2.1 逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-poly merase chain reaction，RT-PCR）法获取ABCB6的c DNA序列

细胞总RNA提取［4］，应用Trizol试剂盒，抽取健康人外周血，分离外周血单个核细胞，提取总RNA。以oligid T为引物逆转录合成c DNA第一链（参照试剂盒说明）。PCR扩增ABCB6 c DNA，PCR反应体系：10×PCR buffer 2μl，2 mmol·L-1d NTP 2μl，P1引物（10μmol·L-1）1μl，P2引物（10μmol·L-1）1μl，逆转录产物4μl，高保真 Pf u DNA聚合酶1.5 U，无菌双蒸水补至20μl。

2.2 重组表达载体pIRES2-Zs Green1-ABCB6的构建

首先经过B glII、E co RI双酶切PCR产物及质粒载体，然后酶切产物经试剂盒回收、纯化，经T4DNA连接酶使目的基因片段与载体片段16℃连接过夜。随后将连接产物转化感受态受体菌DH5α，并将其涂布于卡那霉素琼脂平板上［5］。

2.3 重组表达载体pIRES2-Zs Green1-ABCB6的鉴定

菌落PCR鉴定，随机选取中等大小的4个菌落，接种于3 ml含有卡那霉素（浓度100μg·ml-1）的液体LB培养基中，250 r p m·min-1振摇培养8 h。离心收集细菌，各加200μl无菌双蒸水，100℃沸水煮5 min，离心，取其上清作模板，进行PCR鉴定。酶切鉴定，选取上述PCR鉴定阳性克隆菌落，培养扩菌后，再提取质粒，进一步经B gl II和E co RI双酶切鉴定；选取经菌液PCR鉴定阳性和酶切鉴定阳性的质粒，进一步用DNA测序仪对其进行序列分析，由上海英骏生物技术有限公司完成。测序正确的质粒大量制备。

2.4 转染和单克隆细胞株A375的筛选［5］

A375细胞以含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。转染的前一天胰酶消化细胞，进行细胞计数，将1.5×105个细胞接种到24孔板中。质粒pIRES2-Zs Green1-ABCB6经内切酶AflII切开成线性，以作稳定转染。分别用50μl的无血清OPTI培养 基 稀 释 0.8μg 质 粒 和 2μl LipofectamineTM2000，室温孵育 5 min后，将 Lipof ecta mine T M 2000加入质粒DNA 中，总体积为100μl，轻轻混匀，室温孵育20 min后将质粒和Lipof ecta mine T M 2000混合物加到24孔板，6 h后细胞换液，24 h后加入含G418（浓度为800 mg／L）的培养液筛选，10 d后细胞成簇状生长，有限稀释法挑取单克隆按0.8-1.5 细胞／孔入 96 孔板继续培养，置于 5%CO2培养箱中37℃培养7-10 d。使用荧光显微镜对单个克隆进行逐一观察，记录有绿色荧光的阳性克隆。待阳性细胞克隆长至1／8-1／6孔板大小时，可将其消化。重复有限稀释法挑取单克隆的过程三次，保证筛选得到的细胞克隆为纯的单克隆。将克隆转移至细胞培养瓶中，使用含有维持浓度400μg／ml的G418培养基扩大培养。

结 果

1.RT-PCR结果

RT-PCR产物电泳结果显示，在大约2500 bp处有1条明亮的条带，与ABCB6目的条带大小2529 bp一致（图1）。

2.重组质粒的菌落PCR鉴定结果

重组质粒的菌落经PCR的鉴定结果见图2。可知菌落PCR产物的分子量大小大约是2500 bp，目的条带为2529 bp，故可能是阳性菌落。

3.重组质粒的酶切鉴定结果

扩增经PCR鉴定阳性的菌落，提取其质粒进行双酶（B gl II和Eco RI）切鉴定（图3），泳道1为DNA Mar ker；泳道2和3为重组质粒经B glII和Eco RI双酶切产物，有2条带，其中小片段大约为2500 bp，与目的条带大小相符，大片段为线状空质粒，分子量约为5000bp。提示，重组质粒pIRES2-Zs Green1-ABCB6可能构建成功。

4.重组质粒pIRES2-Zs Green1-ABCB6的测序结果

重组质粒的测序结果经sequencer软件分析，序列与Gen Bank上相应已知序列NM＿005689.2进行同源性比较和分析，未发现任何突变。说明在本研究中，编码ABCB6的重组质粒已被成功构建。

5.ABCB6稳定表达细胞株A375的筛选及鉴定

用pIRES2-Zs Green1-ABCB6质粒转染A375细胞，二个月后获得稳定表达细胞株，荧光显微镜下观察拍照 ，可见细胞全都带有绿色荧光（图4）。

图1 人外周血单个核细胞的ABCB6的RT-PCR产物电泳图2 重组质粒菌落PCR鉴定结果图3 重组质粒的酶切鉴定图4 荧光显微镜下观察pIRES2-Zs Green1-ABCB6稳定转染A375细胞Fig.1 RT-PCR products of ABCB6 from Peripheral blood mononuclear cell from peopleFig.2 Electr ophoresis of reconstr ucted plas mid colonies PCR pr oductsFig.3 Electrophoresis of enzy mes cut identification of reconstructed plas midFig.4 Stable expression of ABCB6 pr otein in A375 cells under the fluorescence microscopy

讨 论

ABCB6是ABC转运蛋白超家族MDR亚家族成员之一［6-7］，带有2个跨膜域（T MD）和1个核苷酸结合域（NBD），在发挥功能过程中往往需经二聚体化形成完整转运体功能单位（4个T MD和2个NBD），因而被称为“半”转运体。ABCB6基因全长2529bp，定位于染色体2q36。ABCB6蛋白质量为97k D，位于线粒体外膜，而且其NBD朝向细胞质，提示ABCB6在能量依赖性线粒体物质转运过程中发挥作用。研究发现人ABCB6与酿酒酵母AT M1具有很强的序列同源性。酵母线粒体突变分析表明：尽管ABCB6只是一种线粒体外膜蛋白，但能补充AT M1缺陷酵母细胞的表型，提示ABCB6有助于维持线粒体呼吸链功能［8-9］，能转运线粒体内Fe／S簇到细胞质，有助于阻止细胞器内铁蓄积和DNA损伤，对维持人体细胞铁平衡和铁硫蛋白成熟具有调节作用，它的功能异常可能直接与线粒体功能紊乱相关。近期研究［9］显示在肝癌、结肠癌等多种肿瘤组织标本中ABCB6呈现高表达状态，而体外实验发现ABCB6在这些肿瘤的耐药细胞中亦表达升高，提示ABCB6在肿瘤的发生发展及耐药过程中发挥一定作用。为了进一步研究ABCB6的生物学功能，我们构建了ABCB6带绿色荧光蛋白的质粒，通过转染黑素瘤A375细胞，筛选获得稳定表达细胞株。成功建立稳定表达ABCB6的黑素瘤A375细胞株为后续进一步的研究奠定了良好基础。

［1］Fukuda Y，Aguilar-Bryan L，Vaxillaire M，et al.Con-ser ved intra molecular disulfide bond is critical to trafficking and fate of ATP-binding cassette（ABC）transporters ABCB6 and sulf onylurea receptor 1 （SUR1）／ABCC8.J Biol Chem，2011，286（10）：8481-8492

［2］Haff ke M，Menzel A，Carius Y，et al.Structures of the nucleotide-binding do main of t he hu man ABCB6 transporter and its co mplexes with nucleotides.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr，2010，66（9）：979-987

［3］Tsuchida M，Emi Y，Kida Y，et al.Hu man ABC transporter isof or m B6 （ABCB6）localizes pri marily in the Golgi apparatus.Biochem Biophys Res Co mmun，2008，369（2）：369-375

［4］张彩娥，邓云华，吴雄文.家族性进行性色素过度沉着症家系的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶11基因的克隆和序列鉴定.新乡医学院学报，2011，28（5）：548-550

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Construction of ABCB6 Expression Vector and Screening of Its Stable A375 Cell Line

Zhang Caie1，Chen Lan2，Ren Weiping2，Mei Aihua2，Deng Yunhua2
（1Depart ment of Anesthesiology，2Depart ment of Der matology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technol ogy，Wuhan 430030，China）

Objective To constr uct t he reco mbinant plas mid pIRES2-Zs Green1-ABCB6 and detect its stable expression in A375 cells.Methods Total RNA was extracted in peripheral blood mononuclear cells fr o m a healt h individual f or reverse transcription of c DNA.PCR wit h designed pri mers was perf or med to amplif y ABCB6，after enzy me digestion by B glII，E co RI，ligation overnight by T4 DNA ligase which was inserted into pIRES2-Zs Green1 vector and t he reco mbinant plas mid pIRES2-Zs Green1-ABCB6 was transf or med into E.coli DH5α.The positive clones were screened and t heir double-stranded DNA sequenced.We got the reco mbinant plas mid of pIRES2-Zs Green1-ABCB6，which was identified by enzy me digestion and DNA sequencing.The reco mbinant plas mid was transfected into A375 cells cult ured in DMEM containing G418.The ABCB6 expression in every stable cell line was detected by fluorescence microscope.Results The reco mbinant plas mid pIRES2-Zs Green1-ABCB6 was verified by enzy me digestion and DNA sequencing.The green fl uorescence in A375 cells transfected wit h pIRES2-Zs Green1-ABCB6 vector was observed under the fl uorescence microscopy.Conclusion The expression vector pIRES2-Zs Green1-ABCB6 is successf ully constr ucted，which can stably express ABCB6 pr otein in A375 cells.

ATP-binding cassette transporter B6；Expression vector；Transfection；A375 cells

R331.1

A

10.3870／zgzzhx.2012.04.008

2012-04-06

2012-06-29

国家自然科学基金资助（81071357，31171228），教育部博士点新教师基金资助（200804871043）

张彩娥，女（1972年），汉族，助理研究员。

＊通讯作者（To who m correspondence should be addressed）