应用TP-ELISA（一步法）检测梅毒螺旋体抗体结果分析

周兆华 王庆丰 顾庆华

常熟市疾病预防控制中心，江苏常熟 215500

梅毒螺旋体抗体酶联吸附免疫试验（TP-ELISA）是随着近年梅毒螺旋体的基因工程抗原研制成功而建立的方法，具有高特异性、高灵敏度高、检测费用低、适宜大批量检测的特点。 2010年12月，我们应用TP-ELISA 一步法检测试剂对娱乐场所2107 名服务人员进行梅毒抗体检测，对阳性标本或灰区标本用TPPA 试剂进行确认， 现将结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象

本市娱乐场所服务人员共2107 名，其中男性488 名，女性1619 名。

1.2 试剂

TP-ELISA 一步法试剂采用上海科华公司生产的，TPPA 试剂采用日本富士公司生产的，RPR 试剂采用上海科华公司生产的，所有试剂均在有效期内。

1.3 方法

应用TP-ELISA 试剂对2107 份标本检测，对灰区标本按1:8，1：16，1:32，1:64，1:128，1:256 稀释倍数检测， 最后用TPPA 试剂对阳性和灰区标本进行确认，并做RPR 滴度试验，灰区OD 值范围设定为0.06～0.20。

1.4 仪器

RPR 旋转仪为新康XK96-6 梅毒旋转振荡器，酶标仪为SUNRISE，洗板机为TECAN。

2 结果

2.1 TP-ELISA、TPPA 和RPR 检测情况

TP-ELISA 法检出阳性标本96 份，经TPPA 确认均为阳性，灰区标本16 份，经TPPA 确认9 份 阳性，7 份阴性。 105 份TPPA 阳性标本中，RPR 阳性43 份，其中原滴阳性12 份，1:2阳 性13 份，1:4 阳 性2 份，1:8 阳 性5 份，1:16 阳 性6 份，1:32阳性5 份。

2.2 灰区标本不同稀释倍数检测情况

TPPA 阳性的9 份灰区标本经1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256 稀释检测，结果显示OD 值在1:16 和1:32 时为最高，反应呈强阳性，RPR 滴度为1:8～1:32，见表1。

表1 9 份灰区标本不同稀释倍数检测OD 值及RPR 滴度

2.3 灰区标本两步法检测OD 值

将一步法试剂分成两步进行，即加血清温育30 min，洗板后加酶标抗原，温育30 min 后显色，结果9 份灰区标本OD 值均明显升高，见表1。

3 讨论

TP-ELISA 是近年来随着梅毒螺旋体基因工程抗原研究成功而建立的方法，操作简单、反应快速、敏感性高、结果易于判断等优点被广泛采用。 但是当标本中梅毒螺旋体抗体浓度很高时会产生钩状效应，标本OD 值会很低或处于灰区，易造成漏检。 钩状效应指待测标本中抗原或抗体浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度随抗原或抗体浓度的增加而开始下降直至不显色，而出现假阴性结果的问题[1]。本次调查显示9 份标本OD 值处于灰区内，TPPA 阳性，RPR 滴度为1:8～1:32，分析其原因应该是高浓度的抗体引起了钩状效应，使标本的OD 值偏低。其中两份OD 值较低，分别是0.065和0.097，按照TP-ELISA 试剂说明书，标本OD 值>0.105 判定为阳性，则这两份标本会漏检，有关报道也指出ELISA 法检测梅毒抗体的吸光度值在0.10～0.15 之间的标本容易出现假阴性[2]。

解决钩状效应的最好办法就是采用两步法试剂，酶标抗原和抗体分两步加入，不存在竞争抑制作用，可以避免钩状效应的产生[3]，本次调查显示9 份灰区标本用两步法检测，OD 值均明显升高，避免了灰区问题。 同时本次调查显示一步法试剂检测稀释后的灰区标本，在1∶16 或1∶32 时获得最强反应，说明存在钩状效应的标本可通过稀释后检测消除，这与有关报道相一致[1，4]。 另外，实际工作中我们发现，有一些TPPA 阳性标本，一步法检测OD 值稍高于灰区，大约0.2～0.4 之间，二步法检测反而呈阴性，这可能是二步法降低了实验的灵敏度。 因此TP-ELISA 一步法试剂初筛梅毒螺旋体抗体，对于灰区标本，可以用稀释法或二步法复测消除钩状效应，做TPPA 试验确认，同时可作RPR 滴度试验，能够避免因钩状效应造成的阳性标本漏检，但是那些因钩状效应引起的OD 值处于设定的灰区以下的标本，还是有漏检可能性。 如果初次检测时，同步做血清原倍和1∶16 稀释检测，可以避免OD 值在灰区或以下的阳性标本漏检，但相应地增加了工作量，如果初检直接用二步法，也可避免灰区阳性标本漏检，但可能会漏检部分弱阳性标本，因此这是个有待解决的问题。

[1] 李金明.血液感染性疾病标志物筛检中应重视的若干问题[J].中华检验医学杂,2005,28(6):569-571.

[2] 李韶深,刘春莉,刘琳,等.梅毒ELISA 和TPPA 两种试验方法的血清质量控制的体会[J].中国皮肤性病学杂志,2005,19(3):183.

[3] 尹琦,徐玉.TP-ELISA 一步法在检测梅毒螺旋体抗体中的钩状效应分析[J].右江医学,2009,37(4)：421-423.

[4] 王海滨,林霞.ELISA 一步法与TPPA 法检测梅毒螺旋体抗体应用分析[J].重庆医学,2009,38(12):1438-1440.