酸奶中嗜热链球菌的分离和性能研究

王俊英,张 杰

(周口师范学院生命科学系,河南周口466001)

酸奶是将乳酸菌接种到灭菌的新鲜牛乳中进行发酵所得的一种乳制品,因其风味独特,口感好,营养丰富,对人体健康有重要作用,深受广大消费者的青睐。目前在国外成熟的乳品市场,酸奶的比例一般会达到40%左右。国内酸奶仅占整个乳品市场份额的15%左右,市场潜力非常大,有将近两倍左右的上升空间。面对这样的形势,对酸奶中乳酸菌的研究成了研究的热点。嗜热链球菌是酸奶中唯一的一种球菌,目前,嗜热链球菌的分离和鉴定[1-2]、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的相互作用是研究的重点[3]。

本试验利用平板划线法从酸奶样品中分离出嗜热链球菌,对其形态特征进行观察,并对其进行生长测试、耐盐测试、凝固性测试、产酸测试、糖发酵测试、明胶水解测试和过氧化氢酶测试,从这些指标里挑选出性能好的菌株。为进一步研究保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的相互作用奠定基础。

1 试验材料

1.1 试验样品

蒙牛益生菌活性酸奶(含嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌),花花牛益生菌活性酸牛奶(含嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌),光明益生菌活性酸牛奶(含嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌)。

1.2 试验试剂

1.2.1 试验所用培养基

改良M17琼脂培养基:胰蛋白胨5.0 g,鱼肉浸出液5.0 g,牛肉膏5.0 g,酵母浸膏2.5 g,抗坏血酸0.5 g,硫酸镁0.25 g,甘油10.0 g,乳糖3.0 g,磷酸氢二钾5.0 g,琼脂20 g,蒸馏水1 000 m L,p H为6.4。糖发酵基础培养基[3],明胶培养基[4]。

1.2.2 试验药品

500 m L无菌水,革兰氏染色液,3%过氧化氢溶液,500 m L新鲜脱脂乳,0.1 mol/L NaOH溶液,1.6%溴甲酚紫,氯化钠,2%酚酞试剂。

1.3 试验仪器

JD200-3型电子天平,电热压力蒸汽灭菌器,HZQF250A型高低温恒温培养箱,JNOEC XSP-24N型显微镜(上海博迅实业有限公司)。

2 试验方法

2.1 酸奶中嗜热链球菌的分离[5]

2.1.1 配制改良M17琼脂培养基

把配制好的改良M17琼脂培养基,分装入锥形瓶内,在0.1 MPa下灭菌20 min。

2.1.2 菌悬液的配制

取6支无菌洁净试管,各盛9 mL无菌生理盐水,将蒙牛酸奶样品搅拌均匀,用移液管取1 m L加入第1支试管中,震荡均匀即成蒙牛10-1稀释液,再用移液管取10-1菌悬液1 m L放入第2支试管中,震荡均匀即可得到10-2蒙牛稀释液,依此可得到蒙牛10-3、10-4、10-5、10-6稀释液,照此方法制备其他两种样品的菌悬液。

2.1.3 接种

每个样品每个浓度取0.05 m L涂布于标有该样品浓度的培养基平皿中,37℃恒温培养箱中培养1～2 d。

2.1.4 纯化

对培养出的菌落进行观察,在各个样品中挑选出不同的菌落,标上序号,无菌操作条件下用平板划线法接种到培养基上,在37℃恒温培养箱中培养1～2 d,进行第一次纯化。照此方法进行第二次纯化。

2.2 酸奶中嗜热链球菌的鉴定[6-8]

2.2.1 菌落特征的观察

在从每种样品分离出来的菌中找出单菌落,对其进行观察,记录其大小、颜色、形状、外形等特征。

2.2.2 镜检

取洁净载玻片,滴加一滴生理盐水,在无菌条件下挑取菌体于无菌水中涂匀。待其干燥后,在酒精灯上固定,然后进行革兰氏染色,结晶紫初染1 min→碘液媒染30 s→酒精脱色30 s→番红复染30 s。干燥后在显微镜下用油镜观察,记录细胞形态特征。

2.2.3 凝固试验

取新鲜脱脂乳10 mL置于试管中,加棉塞,包扎后在0.6 MPa下灭菌20 min,冷却至室温。在超净工作台上接种,每种菌接1支试管,每支试管中接3环,留1支试管不接,作空白对照,然后在37℃恒温培养箱中培养24 h,每4 h观察1次,并记录其凝固情况。

2.2.4 产酸试验

采用酸度滴定法,用吸管吸取5 mL发酵乳于100 mL的三角瓶中,加20 m L蒸馏水混匀,加入2～3滴2%酚酞指示剂,用0.1 mo L/L氢氧化钠滴定至出现粉红色,一分钟不消失为止。

计算酸度:滴定酸度=(滴定消耗的0.1 mo L/L NaOH毫升数)X 20。

2.2.5 糖发酵试验

将配制好的糖发酵基础培养基,按0.5%的比例加入糖或者醇溶液,然后装入杜氏管中,加棉塞,包扎,0.6 MPa下灭菌20 min,冷却至室温。在超净工作台上接种,每种菌接1支,每支试管中接3环菌,留1支试管不接,作空白对照。然后在37℃恒温培养箱中培养24 h,每4 h观察一次,并记录其凝固情况。若培养基的颜色改变,则该菌种对这种糖产酸。小套管内若有气泡,则证明该菌种对这种糖产气。

本次试验使用的糖分别为:葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、棉籽糖、鼠李糖、甘露糖、果糖、半乳糖。另外还有2种醇,分别是甘露醇和山梨醇。

2.2.6 生长试验

将配制好的培养基分装入试管中,灭菌后制成斜面。将菌种分别接入试管中,每种菌接3管。完成之后,一组放在15℃下培养,一组放在45℃条件下培养,另外一组放在37℃条件下培养,作为对照,24 h后观察其生长情况。

2.2.7 耐盐试验

在配制好的M17培养基中按6.5%的比例加入NaCl固体,分装入试管中,灭菌后制成斜面。将菌种分别接入试管中,于37℃条件下培养24 h,观察菌种生长情况。可与生长实验同时进行,取37℃下无盐培养的菌种作为对照。

2.2.8 明胶液化试验

将配制好的明胶培养基分装至试管中,加棉塞包扎灭菌,冷却后进行穿刺接种,每种菌接1管,留1支做空白对照。接种后的菌种置于17℃下培养24 h,观察液化情况。液化的为阳性,不液化的为阴性。

2.2.9 过氧化氢酶试验

具有过氧化氢酶的细菌,能催化过氧化氢生成水和新生态氧,从而形成分子氧出现气泡。将配置好的3%的过氧化氢溶液加入到菌落上,若有气体产生,则过氧化氢酶反应阳性,无气体生成则为过氧化氢酶反应阴性。

3 结果与分析

实验共得到6株菌株:蒙牛里得到3株,分别标作M1、M2、M3;花花牛里得到2株,标作H1、H2;光明里得到1株,标作G1。

3.1 形态特征的观察

通过对菌落进行观察,再进行革兰氏染色后放在显微镜下观察,坚持每纯化一次就镜检一次,保证所得菌的纯度。所得到的6株菌株的形态特征如表1。

由表1观察结果可以看出,所得到的菌落都较小,表面大多比较光滑,颜色为白色或者有些泛黄。革兰氏染色均为阳性,细胞都是圆形或者卵圆形,多个聚集生长或者连成串状。符合《伯杰细菌鉴定手册》中关于嗜热链球菌的描述,而且酸奶中的球菌只有一种。因此初步断定分离出的6株菌株皆为嗜热链球菌[9],但还需要通过生理生化鉴定进一步确认。

表1 形态特征观察结果

3.2 生理生化鉴定

由表2可以看出,这6株菌株都从葡萄糖、蔗糖、果糖产酸,45℃下能生长。革兰氏染色阳性,过氧化氢酶实验阴性,不能水解明胶,细胞都是圆形或者是卵圆形。由《伯杰细菌鉴定手册》可以断定它们符合嗜热链球菌的特征,因此断定它们都是嗜热链球菌,并且耐盐性和耐低温性都比较强。

3.3 菌种的性能鉴定

将凝固试验和产酸试验结果进行综合分析可以判断所得菌株的性能。

由表3可以看出在凝固性实验中M2凝固最快,凝固时间8 h,且凝固的结实,分布均匀,酸度也最高,达到110,是一株优良菌株。M3和H1、H2同时凝固,凝固时间12 h,凝固得也结实,但分布不均匀,又有乳清析出,酸度都在100以上。正常酸奶的酸度在90～110吉尔涅尔度之间,酸奶中乳清的析出影响其质量,因此这3株虽然没有M2好,但是也是不错的菌株。M1和G1在24 h内没有出现凝固现象,只是浓度变大,出现絮状沉淀。酸度也仅在30～40吉尔涅尔度之间,太低,属于不合格菌株。

4 讨论

1 )嗜热链球菌可以帮助人体消化,是人体肠道的有益菌种,也是发酵乳制品的首选菌种之一。但目前酸奶菌种价格昂贵,主要依赖国外进口,这就给酸奶制品的基础研究、工业化生产过程及质量控制造成了一定的影响。本试验从市场上最常见的酸奶产品:蒙牛、花花牛、光明酸牛奶中共分离出6株嗜热链球菌,其中优良菌株1株,合格菌株3株,不合格菌株2株。这样就解决了乳制品工业(特别是实验室基础研究)菌种的来源问题,而且也降低了生产成本、节约了开支。下一步,可以利用本实验分离出的优良嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混合发酵生产各种花色酸奶,从而满足市场上不同消费人群的口味需求。

2 )为了更好地分离菌体,本试验对菌液作了6种不同浓度的稀释(10-1～10-6),结果表明,获得良好分离效果的蒙牛样品最适稀释度为10-5,花花牛和光明样品的最适稀释度均为10-4。

3 )本试验分离嗜热链球菌采用的是改良M17培养基。与传统的标准M17培养基相比,在此培养基上分离获得的菌落数量多、菌落特征明显,生长速度快。

表3 性能鉴定结果

[1]佟潇.酸奶中嗜热链球菌的分离和鉴定[J].中国乳品工业,2004,32(4):25-27.

[2]弥春霞,代志平,杨蕾.酸奶中嗜热链球菌的分离及鉴定[J].牡丹江师范学院学报:自然科学版,2007(3):35-36.

[3]赵鑫,赵洪双,姜国龙.不同比例的嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌对酸奶品质的影响[J].农产品加工.学刊, 2009(3):177-180.

[4]沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验[M].北京:高等教育出版社,2003:116-119.

[5]凌代文.乳酸细菌分离鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工业出版社,1999.

[6]陈芳,靳亚平.奶制品中有益菌的分离鉴定[J].黑龙江畜牧兽医,2007(3):102-103.

[7]陈晓平,刘华英,魏晓川.自然发酵酸菜汁中乳酸菌的分离筛选与鉴定研究[J].食品科学,2006(2):91-93.

[8]齐海萍,周凤娟,胡文忠,等.酸乳发酵菌的分离及酸乳发酵工艺的研究[J].中国酿造,2006(3):31-34.

[9]布坎南.伯杰氏细菌鉴定手册[M].北京:科学技术出版社,1984.