2011年涪陵区生猪养殖场疫病免疫学监测

方勤

（重庆市涪陵区义和镇畜牧兽医站，重庆涪陵 408104）

目前随着生猪养殖业的持续发展，生猪防疫工作的进一步纵向深化，口蹄疫、猪瘟、高致病性蓝耳病等重大疫病免疫逐渐在从重点免疫向全面免疫转变、从季节性免疫向常年免疫转变、从注重密度向既注重密度又注重质量转变。特别是在生猪规模化养殖场，对于一些传染性比较强、危害性比较大的疾病，选择预防接种已经成为防控这类疾病的关键。但是由于疫苗免疫是一个复杂，影响因素极多的过程，当疫苗接种到动物体内后，必须要经过动物机体本身的一系列复杂反应，机体自身的免疫系统才能够产生保护力。而这种保护力往往容易受到除了疫苗以及动物机体本身的影响。对于生猪养殖场的免疫程序是不能一层不变的，适合于该场的免疫程序也许经过两三年就会不太适合，必须根据情况随时加以调整。一些养殖场照搬别场免疫程序或连年不变的做法难免会造成失误而引发该场发病，从而造成本区域内生猪疫病的流行。因此，若有条件应根据实验室监测数据对养殖场生猪的实际抗体水平为依据，并结合当地的实际情况，制定适合于本场的免疫程序。

猪瘟俗称“烂肠瘟”，它是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性传染病。猪瘟病毒（CSFV）属于黄病毒科猪瘟病毒属，CSFV为单股正链RNA有囊膜病毒。自1833年首次在美国俄亥俄州发现CSF。近百年以来，一直在全世界范围内流行，也是目前危害我国养猪业发展的主要疫病之一。中国自主研制的猪瘟兔化弱毒疫苗在防治CSF过程中具有很重要的作用，但近年来各地生猪养殖场仍有CSF免疫效果不理想的情况出现。

猪瘟抗体检测的方法很多，基本都是以病毒中和试验为基础，目前使用最广泛的检测CSF血清抗体的ELISA方法，包括了检测猪瘟病毒的粗蛋白、结构蛋白和非结构蛋白抗体，其中使用最广泛的是CSFV E2 ELISA，即检测猪瘟病毒结构蛋白E2的ELISA，此次我们用来检测猪瘟抗体的试剂盒就是使用的这种检测方法，该检测方法的特异性能达到99%。E2蛋白是CSFV的一个囊膜糖蛋白，分子量大小为51～58kDa，是猪瘟病毒里三个病毒糖蛋白之一，也是猪瘟病毒的主要抗原蛋白。E2蛋白分子内的1 5个Cys残基属于E2蛋白的保守区域，其中N端6个Cys残基主要参与了抗原蛋白结构域的形成，C端9个Cys残基则参与同源、异源二聚体的形成，属于E2蛋白的变异区域。

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的急性、热性、高度接触性传染病。FMD主要侵害偶蹄兽，最易感染的动物是黄牛、水牛、猪、骆驼、羊、鹿等；黄羊、麝、野猪、野牛等野生动物也易感染此病。FMD的临床症状是以病畜全身发热、口腔黏膜及蹄部和乳房皮肤发生水泡和溃烂为特征，是国际兽疫局规定的A类传染病，易通过空气传播，传染性强、发病急、危害大等流行特点。FMD传播无明显的季节性，春秋两季较多。FMDV属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，它有七个血清型且各型之间无交叉保护反应。FMDV含有4种结构蛋白，分 别 为 VP1、VP2、VP3和 VP4，其中VP1蛋白上不仅存在着FMDV主要的抗原位点，还含有病毒受体结合区。

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的特征是猪群发生以繁殖障碍和呼吸系统症状的一种急性、高度传染的病毒性传染病。高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征（俗称蓝耳病）病毒变异株引起的一种急性高致死性疫病。仔猪发病率可达100%、死亡率可达50%以上，母猪流产率可达30%以上，育肥猪也可发病死亡是其特征。PRRSV为动脉炎病毒属的成员，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子呈球型，直径为55～60 nm，病毒有2个血清型，即美洲型和欧洲型，我国分离到的毒株为美洲型。

猪伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病毒(PRV)引起的一种传染病。该病最早发现于美国，后来由匈牙利科学家首先分离出病毒。伪狂犬病毒PRV属于疱疹病毒科猪疱疹病毒属，病毒粒子为圆形，直径150～180 nm，核衣壳直径为105～110 nm。病毒粒子的最外层是病毒囊膜，它是由宿主细胞衍生而来的脂质双层结构。囊膜表面有长约8～10 nm呈放射状排列的纤突。伪狂犬病毒V只有一个血清型，但不同毒株在毒力和生物学特征等方面存在差异。血清学鉴别诊断猪伪狂犬病病毒的方法，是在使用基因标志疫苗的基础上应用的一类诊断方法。由于PRV中存在多个非心需糖蛋白基因，缺失这些基因的病毒突变株从而不能产生被缺失基因所编码的糖蛋白，但是缺失的糖蛋白并不能影响病毒在细胞上的增殖与免疫原性。将这种基因缺失标志疫苗注射动物后，动物不能产生针对缺失蛋白的抗体。因此，可通过血清学方法将自然感染野毒的血清学阳性猪与注苗猪区分开来。

一、材料和方法

（一）材料 2011年1月～12月，对本区的20个大型生猪集约化养殖场，按每个猪场随机抽选种母猪以及15～45日龄的仔猪各10头份，每头份采集全血3～5 ml，并记录好各养殖场的免疫程序。将编号好的猪血分别移至1.5 ml灭菌EP管内，3 000 r/min离心10 min，共计获得了350份合格样品血清。根据养殖场的免疫记录，此次采样所抽选猪群均未接种猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪传染性胸膜肺炎的疫苗，有部分猪场在采样近一个月内曾接种过猪瘟弱毒苗，另外所有猪场均接种过猪口蹄疫及猪伪狂犬病毒活疫苗。

（二）方法

1.猪 瘟。HerdChek猪 瘟 抗体检测试剂盒（CSFV Ab），有效期至2011年4月30日，购自北京爱德士元亨生物科技有限公司。首先将猪瘟抗体检测试剂盒恢复到室温18℃～25℃，将待检血清样品和阴阳性对照血清用样品稀释液做1:1倍稀释（50 μl样品血清中加入50 μl样品稀释液）并加入猪瘟抗体包被板内的检测孔中，轻弹反应板，使反应板中的溶液混匀，在室温下（18℃～25℃）孵育2 h，300 μl洗涤液洗板3次后加入辣根过氧化物酶标记（HRPO）的抗猪瘟病毒的酶标抗体后室温下孵育30 min，洗板显色后加入终止液，然后在450 nm处测定样品及对照的吸光度值，并按照试剂盒说明书对样品血清值进行判断。

2.猪口蹄疫。猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒，有效期至2011年4月，购自上海优耐特生物医药有限公司。试剂盒使用前恢复至室温，对血清样品和阴阳性血清用样品稀释液进行1:10倍稀释后取稀释后液体加入到抗原包被板内的反应孔中，将反应板放置在37℃下孵育60 min后，用300 μl洗涤液洗涤6次拍干，加入100 μl酶结合物，37℃孵育30 min后再洗涤一次后加入底物显色，15 min后加入终止液，然后在450 nm处测定样品及对照的吸光度值，并按照试剂盒说明书对样品血清值进行判断。

3.猪繁殖与呼吸综合征。LSI猪繁殖和呼吸综合征抗体检测试剂盒，有效期至2011年5月，购自上海天之泰生物科技有限公司。试剂盒使用前恢复至室温，对血清样品用样品稀释液进行1：200倍稀释然后取50 μl经稀释后的样品血清加入反应板中（阴阳性对照不用稀释），盖上膜，将反应板放置在37℃下孵育60 min后，用300μl洗涤液洗涤3次拍干，加入50 μl酶标抗体，37℃孵育60 min后再洗涤一次后加入底物显色，10 min后加入终止液，然后在450 nm处测定样品及对照的吸光度值，并按照试剂盒说明书对样品血清值进行判断。

4.猪伪狂犬。猪伪狂犬病病毒gpI抗体检测试剂盒是用于检测猪血清中伪狂犬病病毒（PRV）gpI（又名gpE）抗体，该检测试剂盒是用来检测被检猪是否曾感染PRV的野毒株和或接种过含gpI（gpE）抗原的疫苗，根据涪陵区养殖场实际情况，该试剂盒可用来检测PRV野毒株的感染情况。猪伪狂犬病毒（PRV）gB抗体检测试剂盒是用来检测评估PRV的自然感染或免疫状况。试验步骤及试验结果分别按照试剂盒要求进行。

二、试验结果

（一）猪瘟 对抽选采集的200份生猪血清采用HerdChek猪瘟抗体检测试剂盒进行猪瘟抗体监测，按照试剂盒检测标准，如果被检样品的阻断率大于或等于40%，该样品就可以判为阳性（即有CSFV抗体存在），试验结果见表1。

（二）猪口蹄疫 对抽选采集的200份生猪血清采用猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒，被检样品OD值≥0.23X阳性对照平均OD值判为阳性（即有猪口蹄疫VP1结构蛋白抗体存在），试验结果见表2。

（三）猪繁殖与呼吸综合征 对抽选的猪血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测，根据试剂盒说明书上的标准，试验结果见表3。

（四）猪伪狂犬病 对抽选的猪血清进行猪伪狂犬病毒gpI（gpE）抗体检测，按照试剂盒判断标准200份猪血清样品抗体全为阴性。对抽选的猪血清进行猪伪狂犬病毒gpB抗体检测，按试剂盒说明书上的标准，试验结果见表4。

三、分析与讨论

200份血清样品中猪瘟抗体为阳性的血清有156份，猪瘟抗体阳性率为78%；猪口蹄疫VP1结构蛋白抗体阳性的血清有176份，猪口蹄疫VP1结构蛋白抗体阳性率为88%；猪繁殖与呼吸综合征病毒（高致病性蓝耳病）抗体阳性的血清有68份，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性率为34%；猪伪狂犬病病毒gI抗体为阳性的血清有0份，猪伪狂犬病病毒gB抗体为阳性的血清有185份，猪伪狂犬病抗体阳性率92.50%。

按试验结果，猪瘟免疫抗体合格率达到100%，仔猪抗体合格率为56%。养猪生产中虽然有质量可靠的疫苗用于猪瘟防治，但发生猪瘟的原因很复杂，其中免疫时机，特别是初免时间选择不当是重要的原因之一。关于仔猪出生后其血清中通过母乳获得猪瘟抗体的多少及维持时问长短等问题，一直是兽医工作者所关心的，很多人作过跟踪监测，其结果并不具有统一性 。事实上，仔猪血清中的抗体水平高低和维持时间长短受母体、仔猪个体及饲养管理条件诸多因素的影响，不同的监测对象有不同的结果是自然的，也是可以理解的。怀孕母猪猪瘟抗体水平较高时，仔猪通过母乳获得的抗体是足以抵抗猪瘟病毒侵袭的，并且在哺乳期内一直能够保持较高的抗体水平。一般认为仔猪的母源抗体半衰期为14 d ，从而确定初免时间在仔猪21日龄左右，但在生产实际中，各个单位应该结合自身的实际，及时进行抗体效价的监测，从而确定更合理的免疫时机。

表1 涪陵地区集约化猪场猪瘟血清抗体检测结果

表2 涪陵地区集约化猪场猪口蹄疫VP1结构蛋白血清抗体检测结果

表3 涪陵地区集约化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体检测结果

表4 涪陵地区集约化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体检测结果

种猪口蹄疫VP1结构蛋白抗体种猪免疫合格率为100%，仔猪抗体合格率为88%。涪陵区生猪养殖场猪口蹄疫免疫采取的是二针强制免疫，种猪的免疫抗体效价比仔猪要高。猪伪狂犬病血清抗体检测结果，种猪免疫抗体合格率达99%，仔猪抗体合格率达86%。定期监测对于伪狂犬病的防控和净化非常关键，伪狂犬病gE基因缺失疫苗的广泛应用及相配套的gE—ELISA鉴别诊断方法的商品化，为伪狂犬病的净化和定期监测提供了充分的技术基础。因此规模化猪场一定要注重猪群伪狂犬野毒抗体和免疫抗体的定期监测，gE—ELISA可以监测野毒感染，同时野毒阴性猪群通过gE—ELISA 可以及时了解猪场伪狂犬疫苗免疫效果，制定科学的免疫程序。猪场免疫伪狂犬gE基因缺失疫苗都产生了良好的免疫效果；这些方法和疫苗都可以推广应用，但是为了使猪体免疫力更强，阻止野毒入侵，建议仔猪在首免后，适当时间进行二次加强免疫。

此次调查结果显示20个猪场中所采样品的猪繁殖与呼吸综合征免疫抗体合格率种猪达到68%，仔猪抗体合格率为34%。猪繁殖与呼吸综合征抗体检测结果中，母猪抗体阳性水平超过仔猪，但仍未达到理想水平，表明养殖场均应加强猪繁殖与呼吸综合征的免疫预防。猪繁殖与呼吸综合征有经典型和高致病型，疫苗也有经典株疫苗和高致病性病毒株疫苗两种，按照疫苗种类又分为弱毒和灭活疫苗。涪陵区猪繁殖与呼吸综合征的疫苗除部分场外基本都是采用高致病性病毒株苗，部分生猪养殖场近年来开始使用弱毒苗，从检测数据来看，弱毒苗免疫效果比灭活苗效果要好。据资料报道，PRRSV即便是在血浆中不存在的情况下，也能在几个月里长时间感染生猪，而所有的母猪都易感染PRRS。PRRS活疫苗的出现为猪场免疫提供了另一个选择，但PRRSV变异大，经典毒株和高致病毒株免疫交叉保护的效果好坏还未有共识，猪场在弱毒疫苗的选择上还应结合自身情况考虑毒株。

（略）